頂空氣相色譜法測定半夏糖漿中(-)-薄荷酮和薄荷腦的含量

牛辰瑾，周 軍

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

半夏糖漿是由生半夏、陳皮、枇杷葉、麻黃、紫菀、桔梗、遠志（制）、甘草、薄荷油組成的中藥糖漿劑。多用于咳嗽痰多、支氣管炎，具有止咳化痰的功效。本品收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》（第八冊）?，F(xiàn)行標準起草距今近30年之久，評價方式僅有化學和物理鑒別，和現(xiàn)今倡導的中藥現(xiàn)代化標準有較大差距，查閱相關文獻，有生半夏、枇杷葉、陳皮、甘草、麻黃四味藥材相應的鑒別、含量測定方法報道［1-6］。方中揮發(fā)性成分薄荷油為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyxBriq.的新鮮莖和葉經(jīng)蒸餾、冷凍、部分脫腦加工提取的揮發(fā)油[7]，主要成分為薄荷醇、乙酸薄荷酯、檸檬烯、薄荷酮等，具有祛痰、利膽、抗炎鎮(zhèn)痛的功效［8，9］，作為方中重要成分，僅有采用揮發(fā)油測定法測定薄荷腦含量的報道［10］。此方法取樣量較大，前處理耗時，還需使用毒性較大的環(huán)己烷試劑，而且僅有薄荷腦單一指標成分的含量測定，并不能全面評價處方中揮發(fā)性成分薄荷油的質(zhì)量。本文采用頂空氣相色譜法同時測定（-）-薄荷酮和薄荷腦的含量，簡化樣品前處理步驟，并對市售119批半夏糖漿進行含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent GC 7890B氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。無水乙醇（色譜純，購于天津市康科德科技有限公司）；氯化鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司），水為去離子水。高純氮氣。對照品：（-）-薄荷酮（批號111705-201105，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）、薄荷腦（批號110728-200506，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）；半夏糖漿共119批次，來自市售19家企業(yè)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Agilent HP-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；采取程序升溫：初始溫度90℃，保持2 min，以3℃/min的速率升溫至140℃，保持6 min；再以30℃/min的速率升溫至200℃。進樣口溫度：200℃；采用氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度：250℃；分流比：10∶1；頂空瓶平衡溫度：80 ℃；平衡時間：20 min，進樣量：1 ml。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱?。?）-薄荷酮和薄荷腦適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 ml中分別含1.839和0.888 mg的對照品儲備液。精密量取（-）-薄荷酮對照品儲備液0.2 ml、薄荷腦對照品儲備液1 ml置于同一100 ml量瓶中，加20%NaCl水溶液稀釋至刻度，搖勻，制成（-）-薄荷酮、薄荷腦濃度分別為3.678和8.880 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 ml，置25 ml量瓶中，加20%NaCl水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例和工藝，制備成不含薄荷油的陰性樣品。按“2.2.2”項制備方法制得陰性對照溶液。

2.3 測定方法 精密量取上述3種溶液各1 ml，分別置于頂空進樣瓶中，密封，按“2.1”項下色譜條件進樣測定（-）-薄荷酮和薄荷腦的峰面積。氣相色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關系考查

2.4.1 （-）-薄荷酮線性關系考查 精密稱?。?）-薄荷酮對照品18.39 mg置10 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。將儲備液用20%NaCl水溶液稀釋成濃度為 0.09195、0.367 8、0.735 6、1.839、3.678 和 9.195 μg/ml的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程為Y=37.024 7X-1.180 6（n=6，r=0.999 7），結果表明，（-）-薄荷酮線性在0.091 95～9.195 0 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.2 薄荷腦線性關系考查 精密稱取薄荷腦對照品27.75 mg置25 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。將儲備液用20%NaCl水溶液稀釋成濃度為 0.555、1.11、2.22、5.55、11.1、22.2和44.4 μg/ml的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程為Y=41.326 2X+10.153 2（n=7，r=0.999 9）。結果表明，薄荷腦線性在 0.555～44.4 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1 陰性樣品（A）對照品（B）供試品（C）GC色譜圖

2.5 檢出限與定量限的確定 精密稱取（-）-薄荷酮對照品濃度為1.424 μg/ml的溶液1和3 ml分別置50 ml量瓶中，加20%NaCl水溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取薄荷腦對照品濃度為5.845 μg/ml的溶液1和3 ml分別置100 ml量瓶中，制成不同濃度的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果（-）-薄荷酮定量限為0.085 44 μg/ml，薄荷腦定量限為0.175 35 μg/ml；（-）-薄荷酮檢出限為 0.028 48 μg/ml，薄荷腦檢出限為0.058 45 μg/ml。

2.6 精密度試驗 取同一份供試品溶液，精密吸取1 ml置頂空進樣瓶中，共 6 瓶，分別進樣，（-）-薄荷酮和薄荷腦RSD分別為1.83%和1.12%，證明該測定方法精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次供試樣品（批號201711001）6份，按照“2.2.2”項方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定每份樣品中（-）-薄荷酮和薄荷腦的含量。結果平均含量分別為0.077 72和 0.178 9 mg/ml，RSD 分別為 2.39%和1.21%，該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取重復性中的一份供試品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12和18 h測定樣品中（-）-薄荷酮和薄荷腦峰面積，其RSD分別為1.66%和1.26%，結果表明供試品溶液在18 h內(nèi)測定含量穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗 取同一批半夏糖漿（批號201711001）供試品6份，每份精密量取0.5 ml，加入與供試品中各組分濃度相當?shù)膶φ掌啡芤海础?.2.2”制備成加樣回收供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結果（-）-薄荷酮平均回收率為99.94%，RSD為2.21%；薄荷腦平均回收率為99.34%，RSD為1.45%。見表1和表2。

表1 (-)-薄荷酮回收率試驗結果

表2 薄荷腦回收率試驗結果

2.10 樣品含量測定 取19個廠家的119批半夏糖漿樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算（-）-薄荷酮和薄荷腦的含量，結果見表3，統(tǒng)計結果見表4。

表3 （-）-薄荷酮和薄荷腦含量測定結果

表4 19個廠家(-)-薄荷酮和薄荷腦分析結果

3 討論

3.1 提取條件的考查 （-）-薄荷酮和薄荷腦均為易揮發(fā)成分，在樣品前處理方法試驗中，分別考查揮發(fā)油提取法、乙酸乙酯萃取法和頂空進樣法，樣品采用揮發(fā)油提取法，前處理時間過長，樣品需進行脫水處理，難以避免揮發(fā)性成分的損失，采用乙酸乙酯萃取法，不可避免地有一些共萃物干擾分析［11］，進樣后易污染色譜系統(tǒng)，降低色譜柱的使用壽命［12］。樣品經(jīng)稀釋后直接頂空進樣，不僅縮短了前處理時間，而且減少了樣品基質(zhì)的干擾，最后確定采取頂空進樣法對兩種成分進行含量測定。

3.2 頂空進樣條件考查 在頂空進樣中分別考查了頂空平衡溫度、平衡時間、樣品稀釋溶劑和樣品稀釋倍數(shù)。溶液稀釋溶劑為水溶液，一般來說溫度越高，頂空氣體的濃度就越高，但溫度過高會造成水蒸氣進入氣相色譜，對儀器造成損害，本試驗考查了70、80和90℃，其中平衡溫度為80℃時，樣品峰面積明顯高于70℃，平衡溫度為90℃時，峰面積與80℃時無顯著差別，最終選擇80℃為頂空平衡溫度。頂空平衡時間考查了10、20和30 min，結果顯示樣品在加熱20 min時即可達到平衡，故加熱時長為20 min。除去考慮到樣品所測成分的揮發(fā)性外，樣品的基質(zhì)也對含量測定有一定影響，為消除基質(zhì)效應，還分別考查了樣品稀釋倍數(shù)和稀釋溶劑。樣品不稀釋直接進樣和用水稀釋2、5、10、25和50倍，結果表明稀釋倍數(shù)越高，基質(zhì)的影響越低，但靈敏度也隨之降低，影響含量測定結果，最終選擇稀釋25倍進樣。在樣品中加入無機鹽電解質(zhì)，達到鹽析作用，提高頂空瓶揮發(fā)性成分濃度，所以稀釋溶劑考查了水、10%、20%、30%NaCl水溶液和飽和NaCl水溶液，其中水作為稀釋溶劑的樣品含量最低，飽和NaCl水溶液樣品所測含量最高，但飽和NaCl溶液容易鹽析，20%和30%NaCl水溶液所測含量結果差異不大，最后選擇20%NaCl水溶液為稀釋溶劑。

3.3 樣品測定結果 采用頂空氣相色譜法對19個廠家共119批次半夏糖漿中（-）-薄荷酮和薄荷腦進行含量測定，結果表明個別廠家不同批次間兩種成分的含量差異較大，如廠家J和R樣品中（-）-薄荷酮和薄荷腦各批次間差異較大，兩組分最高含量和最低含量的比值均在30以上，不同廠家產(chǎn)品差異較大的原因可能與各企業(yè)的生產(chǎn)工藝相關和儲存條件有關。而廠家K有3批樣品均未檢出（-)-薄荷酮，僅檢測出薄荷腦，其供試品溶液僅有薄荷腦，有可能廠家為節(jié)約成本只投料薄荷腦，而未按照處方中要求投料薄荷油，或者廠家投料所使用的薄荷油質(zhì)量較差。

結合（-）-薄荷酮、薄荷腦測定值，經(jīng)計算，19家企業(yè)樣品中（-）-薄荷酮含量平均為0.0464 mg/ml，薄荷腦含量平均為0.149 6 mg/ml，因上述兩種成分易揮發(fā)，導致其含量降低，按（-）-薄荷酮、薄荷腦平均值的50%計算，擬定（-）-薄荷酮、薄荷腦分別不得低于0.023 2和0.074 8 mg/ml。照薄荷油擬定限度，本次抽驗合格率為52.1%，不合格率為47.9%，涉及11家企業(yè)的57批樣品，其中（-）-薄荷酮合格率52.94%，共有56批樣品不合格，薄荷腦合格率78.15%，共26批樣品不合格。兩個成分均不合格共有25批樣品。分析不合格的原因可能有以下幾個方面：①生產(chǎn)中使用的薄荷油有效成分含量較低；②未按處方進行投料；③薄荷油易揮發(fā)，存儲方式不當。因此，有必要更新半夏糖漿的含量檢測項目。

綜上所述，該方法操作簡單、精密度好、準確可靠，可用于半夏糖漿中（-）-薄荷酮和薄荷腦含量測定