頂空氣相色譜法測定眼氨肽制劑中乙醇?xì)埩袅?/h1>
2020-09-21 12:17:34覃婷婷伏圣青黃哲甦
天津藥學(xué) 2020年2期
覃婷婷，伏圣青，黃哲甦
（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）
眼氨肽制劑包括眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液，二者均以?；蜇i的動物眼球?yàn)樵希?jīng)高濃度的乙醇提取等工藝制得眼氨肽提取液后，進(jìn)一步滅菌或加抑菌劑經(jīng)無菌操作制得注射液或滴眼液，該類制劑主要用于治療角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視［1-3］，臨床上也用于治療角膜上皮持續(xù)性缺損、干眼癥等眼科疾?。?-6］。眼氨肽制劑作為多組分提取藥物成分復(fù)雜，不僅含有多種氨基酸和多肽［7］，同時藥物中還可能殘留大分子蛋白［8］等容易引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)，筆者前期均進(jìn)行了深入分析。此外，眼氨肽制劑的生產(chǎn)工藝采用高濃度的乙醇進(jìn)行提取，提取液中會有乙醇?xì)埩?，另外部分眼氨肽滴眼液產(chǎn)品中加入的羥苯酯類抑菌劑使用乙醇作為溶劑，也可能使眼氨肽滴眼液終產(chǎn)品中殘留乙醇。乙醇?xì)埩艨蓪?dǎo)致急性中毒，因此，有必要控制眼氨肽制劑中乙醇的殘留量。目前眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均收載在《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第九冊中，均未對乙醇?xì)埩袅窟M(jìn)行控制，存在著較大的風(fēng)險隱患，且目前尚未見測定眼氨肽制劑中乙醇?xì)埩袅康南嚓P(guān)報(bào)道。此次，筆者參考相應(yīng)文獻(xiàn)［9-13］，采用頂空氣相色譜法并對其參數(shù)加以優(yōu)化，建立眼氨肽滴眼液、注射液中乙醇?xì)埩袅康臏y定方法，并對部分市售樣品進(jìn)行監(jiān)測分析，以期為該類制劑的質(zhì)量監(jiān)管提供新的技術(shù)支撐，有助于推進(jìn)眼氨肽制劑整體質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)體系的完善。
1 儀器與試藥
7980A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；XS-204萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。眼氨肽滴眼液（A 公司，批號 160601、180201；B 公司，批號161001、161102、171004）；眼氨肽注射液（C 公司，批號57170701、58170703、57190301）；無水乙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號181226）；正丙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號170425），水為純化水。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜柱為CP-WAX 52 CB FS（50 m×0.32 mm，5 μm）毛細(xì)管柱；升溫程序：起始溫度為 70℃，維持8 min，以40℃/min速率升溫至200℃，維持10 min；進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測器為火焰離子化檢測器（FID）；檢測溫度為220℃；載氣為氮?dú)?；流速?.5 ml/min；分流比為 20∶1；頂空進(jìn)樣量為 1 ml；頂空平衡溫度為85℃；頂空平衡時間為20 min。
2.2 溶液的制備
2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取正丙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含0.1 mg的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。
2.2.2 對照品溶液 取無水乙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含1mg的溶液作為對照品貯備液。精密量取1 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。
2.2.3 供試品溶液 精密量取本品5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
2.2.4 陰性對照溶液 以水作為陰性對照溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密量取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果陰性對照無干擾，乙醇和正丙醇分離度大于1.5。見圖1。
圖1 對照品（A）供試品（B）陰性對照（C）GC色譜圖
2.4 線性關(guān)系考查 分別精密量取乙醇對照品貯備液 0.002、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 和 1.5 ml至內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，乙醇與正丙醇峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果在0.4～303.4 μg/ml濃度范圍內(nèi)，乙醇與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與乙醇濃度呈良好線性關(guān)系，線性方程為Y=0.005 4X-0.005 7（r=0.999 9）。
2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對照品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，同法制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄乙醇與正丙醇峰面積比值，RSD為1.35%。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號160601）照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析進(jìn)樣分析，乙醇平均殘留量為0.81 mg/ml，RSD為0.53%。
2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批供試品（批號160601），精密量取供試品2.5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，平行制備9份，分別精密加入對照品貯備液0.15、0.20和0.25 ml各3份，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為加樣回收溶液。分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果乙醇平均回收率為100.28%，RSD為1.80%。見表1。
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）
2.8 檢出限和定量限試驗(yàn) 精密量取乙醇對照品貯備液用水逐步稀釋，精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比為3∶1時，檢出限為0.1 μg/ml；當(dāng)信噪比為 10∶1 時，定量限為 0.4 μg/ml。
2.9 樣品中乙醇?xì)埩袅繙y定 取5批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中乙醇?xì)埩袅?，結(jié)果見表2。
表2 樣品中乙醇?xì)埩袅繙y定結(jié)果
3 討論
3.1 方法的選擇 眼氨肽制劑為多組分生化藥物，成分復(fù)雜，如選擇溶液直接進(jìn)樣法測定乙醇，可能會對測定造成干擾，且對儀器進(jìn)樣口和色譜柱造成損害，故本研究采用頂空進(jìn)樣法，只測定揮發(fā)性成分，干擾少，分離度好。
3.2 頂空溫度的選擇 本研究分別考查了75、80、85和90℃的頂空平衡溫度，結(jié)果顯示，隨著溫度的上升，乙醇和正丙醇的峰面積均增大，樣品在上述溫度的頂空條件下，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值變化不大，在85℃時比值達(dá)最大值，因此選擇85℃作為頂空平衡溫度。
3.3 頂空平衡時間的選擇 本試驗(yàn)分別考查了10、20和30 min的頂空平衡時間，結(jié)果顯示，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值在10 min后變化不大，在20 min時，乙醇峰面積與正丙醇峰面積均達(dá)到最大值，故選擇20 min作為頂空平衡時間。
3.4 乙醇?xì)埩袅勘O(jiān)測的意義 按照《中國藥典》2015年版通則［14］0861殘留溶劑測定法的要求，乙醇為第三類溶劑，應(yīng)按藥品GMP或其他質(zhì)量要求加以限制使用，并將其限量定為0.5%。本文建立了簡便、準(zhǔn)確的方法用于測定眼氨肽制劑的乙醇?xì)埩袅?，并對市售?批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果均檢出乙醇，測定結(jié)果在0.03%～0.1%之間，未超過0.5%，符合《中國藥典》要求。不過，本次檢測樣品數(shù)量較為有限，考慮到乙醇?xì)埩艨蓪?dǎo)致急性中毒，建議企業(yè)及藥檢部門有必要在日常工作中重視對眼氨肽制劑中乙醇?xì)埩袅康谋O(jiān)測與控制。
覃婷婷，伏圣青，黃哲甦
（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）
眼氨肽制劑包括眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液，二者均以?；蜇i的動物眼球?yàn)樵希?jīng)高濃度的乙醇提取等工藝制得眼氨肽提取液后，進(jìn)一步滅菌或加抑菌劑經(jīng)無菌操作制得注射液或滴眼液，該類制劑主要用于治療角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視［1-3］，臨床上也用于治療角膜上皮持續(xù)性缺損、干眼癥等眼科疾?。?-6］。眼氨肽制劑作為多組分提取藥物成分復(fù)雜，不僅含有多種氨基酸和多肽［7］，同時藥物中還可能殘留大分子蛋白［8］等容易引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)，筆者前期均進(jìn)行了深入分析。此外，眼氨肽制劑的生產(chǎn)工藝采用高濃度的乙醇進(jìn)行提取，提取液中會有乙醇?xì)埩?，另外部分眼氨肽滴眼液產(chǎn)品中加入的羥苯酯類抑菌劑使用乙醇作為溶劑，也可能使眼氨肽滴眼液終產(chǎn)品中殘留乙醇。乙醇?xì)埩艨蓪?dǎo)致急性中毒，因此，有必要控制眼氨肽制劑中乙醇的殘留量。目前眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均收載在《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第九冊中，均未對乙醇?xì)埩袅窟M(jìn)行控制，存在著較大的風(fēng)險隱患，且目前尚未見測定眼氨肽制劑中乙醇?xì)埩袅康南嚓P(guān)報(bào)道。此次，筆者參考相應(yīng)文獻(xiàn)［9-13］，采用頂空氣相色譜法并對其參數(shù)加以優(yōu)化，建立眼氨肽滴眼液、注射液中乙醇?xì)埩袅康臏y定方法，并對部分市售樣品進(jìn)行監(jiān)測分析，以期為該類制劑的質(zhì)量監(jiān)管提供新的技術(shù)支撐，有助于推進(jìn)眼氨肽制劑整體質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)體系的完善。
1 儀器與試藥
7980A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；XS-204萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。眼氨肽滴眼液（A 公司，批號 160601、180201；B 公司，批號161001、161102、171004）；眼氨肽注射液（C 公司，批號57170701、58170703、57190301）；無水乙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號181226）；正丙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號170425），水為純化水。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜柱為CP-WAX 52 CB FS（50 m×0.32 mm，5 μm）毛細(xì)管柱；升溫程序：起始溫度為 70℃，維持8 min，以40℃/min速率升溫至200℃，維持10 min；進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測器為火焰離子化檢測器（FID）；檢測溫度為220℃；載氣為氮?dú)?；流速?.5 ml/min；分流比為 20∶1；頂空進(jìn)樣量為 1 ml；頂空平衡溫度為85℃；頂空平衡時間為20 min。
2.2 溶液的制備
2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取正丙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含0.1 mg的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。
2.2.2 對照品溶液 取無水乙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含1mg的溶液作為對照品貯備液。精密量取1 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。
2.2.3 供試品溶液 精密量取本品5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
2.2.4 陰性對照溶液 以水作為陰性對照溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密量取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果陰性對照無干擾，乙醇和正丙醇分離度大于1.5。見圖1。
圖1 對照品（A）供試品（B）陰性對照（C）GC色譜圖
2.4 線性關(guān)系考查 分別精密量取乙醇對照品貯備液 0.002、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 和 1.5 ml至內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，乙醇與正丙醇峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果在0.4～303.4 μg/ml濃度范圍內(nèi)，乙醇與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與乙醇濃度呈良好線性關(guān)系，線性方程為Y=0.005 4X-0.005 7（r=0.999 9）。
2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對照品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，同法制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄乙醇與正丙醇峰面積比值，RSD為1.35%。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號160601）照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析進(jìn)樣分析，乙醇平均殘留量為0.81 mg/ml，RSD為0.53%。
2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批供試品（批號160601），精密量取供試品2.5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，平行制備9份，分別精密加入對照品貯備液0.15、0.20和0.25 ml各3份，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為加樣回收溶液。分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果乙醇平均回收率為100.28%，RSD為1.80%。見表1。
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）
2.8 檢出限和定量限試驗(yàn) 精密量取乙醇對照品貯備液用水逐步稀釋，精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比為3∶1時，檢出限為0.1 μg/ml；當(dāng)信噪比為 10∶1 時，定量限為 0.4 μg/ml。
2.9 樣品中乙醇?xì)埩袅繙y定 取5批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中乙醇?xì)埩袅?，結(jié)果見表2。
表2 樣品中乙醇?xì)埩袅繙y定結(jié)果
3 討論
3.1 方法的選擇 眼氨肽制劑為多組分生化藥物，成分復(fù)雜，如選擇溶液直接進(jìn)樣法測定乙醇，可能會對測定造成干擾，且對儀器進(jìn)樣口和色譜柱造成損害，故本研究采用頂空進(jìn)樣法，只測定揮發(fā)性成分，干擾少，分離度好。
3.2 頂空溫度的選擇 本研究分別考查了75、80、85和90℃的頂空平衡溫度，結(jié)果顯示，隨著溫度的上升，乙醇和正丙醇的峰面積均增大，樣品在上述溫度的頂空條件下，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值變化不大，在85℃時比值達(dá)最大值，因此選擇85℃作為頂空平衡溫度。
3.3 頂空平衡時間的選擇 本試驗(yàn)分別考查了10、20和30 min的頂空平衡時間，結(jié)果顯示，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值在10 min后變化不大，在20 min時，乙醇峰面積與正丙醇峰面積均達(dá)到最大值，故選擇20 min作為頂空平衡時間。
3.4 乙醇?xì)埩袅勘O(jiān)測的意義 按照《中國藥典》2015年版通則［14］0861殘留溶劑測定法的要求，乙醇為第三類溶劑，應(yīng)按藥品GMP或其他質(zhì)量要求加以限制使用，并將其限量定為0.5%。本文建立了簡便、準(zhǔn)確的方法用于測定眼氨肽制劑的乙醇?xì)埩袅?，并對市售?批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果均檢出乙醇，測定結(jié)果在0.03%～0.1%之間，未超過0.5%，符合《中國藥典》要求。不過，本次檢測樣品數(shù)量較為有限，考慮到乙醇?xì)埩艨蓪?dǎo)致急性中毒，建議企業(yè)及藥檢部門有必要在日常工作中重視對眼氨肽制劑中乙醇?xì)埩袅康谋O(jiān)測與控制。
