京大戟對(duì)斑馬魚胚胎血管生成的影響

梁文舉，倪璐，張文婷，陳揚(yáng)，劉妍，劉靜，趙苑伶,林瑞超，郝巨輝,馬志強(qiáng)*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102; 2.中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

研究表明，抗血管新生療法是以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過降低血管活性因子的活性、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、改變腫瘤生長微環(huán)境，從而抑制腫瘤生長過程所必需的血管新生，切斷腫瘤的供養(yǎng)，最終達(dá)到遏制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移目的一種腫瘤治療方法[1-2]；該方法具有高效特異性、不易產(chǎn)生耐藥性、藥物易于到達(dá)靶部位和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，現(xiàn)在已成為抗腫瘤血管生成藥物研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。在抗血管藥物活性篩選中，斑馬魚因其高通量，給藥方便、胚胎透明、胚胎發(fā)育快、血管生成模式簡單且在顯微鏡下可直接觀察到血管形態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，已成為篩選抗血管生成藥物的理想動(dòng)物模型[5]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管新生活性，但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確[6]。活性導(dǎo)向是對(duì)中藥化學(xué)成分分離、探索中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的重要方法。故本研究采用斑馬魚為模型動(dòng)物，以抗血管生成活性為前提，探究京大戟不同極性提取部位對(duì)斑馬魚胚胎血管生成的影響，為闡明京大戟抗血管生成的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器和試藥

京大戟飲片(購自河北安國藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為正品)；斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)；Axio Zoom V16體式熒光顯微鏡(Zeiss，Germany)；HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環(huán)?？萍加邢薰?；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BPZ-6033LC真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；MS205DU電子分析天平(瑞士METTLER公司)；LRH-250Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(flk1:mCherry)(中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心)。

1.3 試劑與耗材

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、碳酸氫鈉等均為分析純(北京化工廠)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純(北京化工廠)；15 cm玻璃培養(yǎng)皿，12孔板、錫箔紙、巴斯德吸管，Vatalanib 2HCl(PTK787)(Selleck Chemicals,Houston,TX)。

2 方法

2.1 斑馬魚成魚飼養(yǎng)及胚胎繁殖

飼養(yǎng)條件：北京愛生斑馬魚繁殖系統(tǒng)，全封閉循環(huán)，水溫(28±0.5)℃，pH值7.2～7.4，電導(dǎo)率530～550 μs/cm，14 h∶10 h明暗交替。

胚胎繁殖：選擇生長狀態(tài)良好的斑馬魚以雌雄比為1∶1進(jìn)行繁殖，用隔板將雌雄斑馬魚分開，于次日清晨抽去隔板，繁殖完成后，將成魚取出放回養(yǎng)殖系統(tǒng)，收集狀態(tài)良好的斑馬魚胚胎，置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。

胚胎培養(yǎng)水的配制：按照Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制：0.137 mol/L NaCl、5.4 mol/L KCl、0.25 mol/L Na2HPO4、0.44 mol/L K2HPO4、1.3 mol/L CaCl2、1.0 mol/L MgSO4、4.2 mol/L NaHCO3的水溶液。

2.2 京大戟不同極性部位的提取

京大戟飲片粉碎過40目篩，稱取20 g，精密稱定，置索氏提取器中，分別以10倍體積量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇為提取溶劑，按序依次回流提取，每次提取均至索氏提取器回流管中提取液無色，更換提取溶劑時(shí)需揮干上一種提取溶劑，分別收集各提取液，減壓濃縮，真空干燥至恒重，稱重研磨粉碎待用。

2.3 京大戟不同極性部位對(duì)斑馬魚胚胎血管生成的影響

在體式顯微鏡下挑選發(fā)育良好且胚胎發(fā)育至6 hpf(hours past fertilization，即受精后小時(shí)數(shù))的魚卵。將挑出的魚卵置于12孔板中，每孔20只胚胎，分別暴露在3 mL不同對(duì)照組及供試組溶液中。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以含有0.1% DMSO的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配置濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的京大戟石油醚提取物(PET)、二氯甲烷提取物(DCM)、乙酸乙酯提取物(EA)，以及濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL甲醇提取物(MeOH)供試品溶液。同時(shí)，給予濃度為100 ng/mL的PTK787為陽性對(duì)照組；以及含有0.1% DMSO的胚胎培養(yǎng)水為空白對(duì)照組。每24 h更換一次培養(yǎng)液，在28 ℃下、在14 h/10 h的晝夜周期中培養(yǎng)至72 hpf，在體式顯微鏡下觀察節(jié)間血管生成情況并拍照，統(tǒng)計(jì)完整節(jié)間血管數(shù)[完整的血管指的是斑馬魚節(jié)間血管能夠連接背縱吻合血管(DLAV)和背主動(dòng)脈(DA)的節(jié)間血管]。平行重復(fù)3次。

2.4 京大戟甲醇提取部位的不同洗脫組分對(duì)斑馬魚胚胎血管生成的影響

根據(jù)不同極性部位結(jié)果，選取毒性較低，活性較好的甲醇部位進(jìn)行下一步硅膠柱層析分離純化，使用20% ～ 100%的甲醇水溶液梯度洗脫，得到20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇,共5組洗脫組分，減壓濃縮，真空干燥至恒重，稱重研磨粉碎待用。以含有0.1% DMSO的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，均配置成濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的供試品溶液，顯微鏡下選取發(fā)育良好且胚胎發(fā)育至6 hpf的魚卵，按“2.3”項(xiàng)下處理，對(duì)洗脫部位的活性進(jìn)一步進(jìn)行考察。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 京大戟不同極性部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生成的影響

結(jié)果顯示，空白對(duì)照組斑馬魚節(jié)間血管生長良好，節(jié)間血管呈均勻縱向排列，完整無缺失，無斷裂。陽性對(duì)照組斑馬魚體節(jié)間血管缺失明顯。石油醚提取部位處理組處理組斑馬魚節(jié)間血管均勻縱向排列，完整無缺失，對(duì)斑馬魚胚胎血管生長無明顯抑制作用(P>0.05)，二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇提取部位3組處理組斑馬魚節(jié)間血管均出現(xiàn)血管缺失現(xiàn)象，對(duì)斑馬魚胚胎血管具有明顯的抑制作用，且隨著給藥濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。但在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察到經(jīng)石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取部位處理過的斑馬魚幼魚在所有濃度下均出現(xiàn)卵黃腫大、體態(tài)彎曲和部分死亡現(xiàn)象，且隨著劑量增大，死亡和致畸數(shù)量增多，在40 μg/mL以上全部死亡，這一現(xiàn)象表明這三種極性提取部位毒性較強(qiáng)。具體見表1、圖1。

表1 京大戟不同極性部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生成情況的影響

注：A.石油醚組；B.二氯甲烷組；C.乙酸乙酯組；D.甲醇組。圖1 京大戟不同極性部位對(duì)斑馬魚胚胎節(jié)間血管生成的影響

3.2 京大戟甲醇層不同部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生成的影響

結(jié)果顯示，空白對(duì)照組斑馬魚節(jié)間血管生長良好，節(jié)間血管呈均勻縱向排列，完整無缺失，無斷裂。陽性對(duì)照組斑馬魚體節(jié)間血管缺失明顯。5組京大戟不同甲醇洗脫部位處理組均出現(xiàn)血管缺失現(xiàn)象，即5個(gè)處理組的血管生成均受到一定程度的抑制。在統(tǒng)一設(shè)定的3個(gè)濃度下，20%甲醇和80%甲醇洗脫部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的抑制呈濃度依賴性；其余3個(gè)處理組的抑制效果無濃度依賴關(guān)系。具體見表2、圖2。

3.3 京大戟20%、80%甲醇洗脫部位和甲醇提取物抑制血管生成活性對(duì)比

對(duì)京大戟甲醇提取部位與20%、80%甲醇洗脫部位進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在相同給藥劑量下，甲醇提取部位和20%、80%甲醇洗脫部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生成均有抑制效果，且隨著濃度增大，抑制效果增強(qiáng)。其中20%、80%甲醇洗脫部位抑制效果強(qiáng)于甲醇提取部位。具體見圖3。

表2 京大戟甲醇不同組分部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生成情況的影響

注：A.20%甲醇洗脫部位；B.40%甲醇洗脫部位；C.60%甲醇洗脫部位；D.80%甲醇洗脫部位；E.100%甲醇洗脫部位。圖2 京大戟甲醇提取物不同部位對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的抑制作用

注：A.甲醇提取部位；B.20%甲醇洗脫部位；C.80%甲醇洗脫部位。圖3 京大戟20%、80%甲醇洗脫部位和甲醇提取物抑制血管生成活性比較

4 討論

新血管的形成能加速腫瘤的生長發(fā)育并促進(jìn)轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發(fā)生的[7-8]，若能抑制腫瘤血管生成，則可達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的，因此，“抗血管生成療法”已成為腫瘤靶向治療的重要研究領(lǐng)域之一[9]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管生成效果，其中mRNA結(jié)果顯示，京大戟水提物可抑制部分腫瘤血管生成的相關(guān)基因的表達(dá)，但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確[6]。本研究以抗血管生成活性為導(dǎo)向，采用血管熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為模型動(dòng)物，探究京大戟石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇四種不同極性部位提取物對(duì)斑馬魚胚胎節(jié)間血管的影響。結(jié)果顯示，京大戟石油醚提取物對(duì)斑馬魚胚胎節(jié)間血管生成無抑制作用，剩余三種對(duì)斑馬魚胚胎節(jié)間血管生成具有抑制作用，且均呈劑量依賴性。這可能是由于三種有機(jī)試劑在提取過程中存在不同極性成分的重疊造成的，即使用不同極性的溶劑在連續(xù)提取過程中無法將成分按照極性的不同區(qū)分開。此外，不同極性的提取溶劑在斑馬魚胚胎毒性表現(xiàn)上具有較大的區(qū)別。石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯三種提取部位具有較強(qiáng)的毒性，在較低的給藥范圍內(nèi)，斑馬魚胚胎均出現(xiàn)體態(tài)彎曲、卵黃腫大，乃至死亡。在相同療效下，甲醇提取物組雖給藥濃度較大，但安全性更好，在給藥范圍內(nèi)，未出現(xiàn)致畸和死亡現(xiàn)象。

本研究結(jié)果表明二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇三種不同極性提取部位對(duì)斑馬魚胚胎血管生成具有較好的抑制作用，綜合毒性和活性表現(xiàn)，選擇甲醇提取部位進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。不同濃度的甲醇洗脫溶液對(duì)斑馬魚胚胎血管生成均具有不同程度的抑制作用，其中20%甲醇和80%甲醇兩組呈濃度依賴性。為后續(xù)京大戟抗血管生成的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考和依據(jù)。