繼代培養(yǎng)中馬尾松生根能力及其與內源激素含量的相關分析*

王 胤 姚瑞玲

(廣西林業(yè)科學研究院 南寧 530002)

馬尾松(Pinusmassoniana)是我國亞熱帶地區(qū)特有的脂材兩用鄉(xiāng)土造林樹種，綜合利用價值高、推廣前景廣闊，不僅可用于生產三板、造紙及化纖工業(yè)制造，還可用作生產松香、松節(jié)油等工業(yè)原料(楊章旗等， 2011)。廣西林業(yè)科學研究院多年來一直從事馬尾松良種選育方面的工作，先后選育了‘寧明桐棉’、‘忻城古蓬’、‘容縣浪水’等速生、優(yōu)質、高產優(yōu)良種源11個。其中，寧明桐棉種源(桐棉松)在全國17個省(區(qū))的馬尾松全分布地理種源試驗中表現優(yōu)異，通過了國家良種審定，是我國最為優(yōu)良的馬尾松地理種源之一。桐棉松干形通直、皮薄、生長快、產量高，是馬尾松骨干育種資源(楊章旗等， 2011)。然而，馬尾松種源、家系遺傳分化差異較大，人工林生產力普遍不高，嚴重制約了馬尾松產業(yè)的快速發(fā)展(楊模華等， 2011)。通過無性快繁技術進行無性系育林，是實現馬尾松人工林集約高效定向培育的重要途徑。受扦插母株生理年齡效應的影響(季孔庶等，1996)，利用組織培養(yǎng)技術，加快馬尾松優(yōu)良無性系繁育與利用。

松屬(Pinus)植物由于松脂分泌代謝旺盛、萌蘗能力差及生理年齡效應顯著等問題，組培屬世界性難題(楊模華等， 2011； 伊書亮等， 2013； Jainetal.， 2005； Yaoetal.， 2016)。目前，國內外有關松樹成年植株離體再生培養(yǎng)成功方面的報道仍鮮少見。在馬尾松莖芽離體培養(yǎng)前期研究中，發(fā)現外植體幼化是獲取莖芽離體培養(yǎng)成功的關鍵(Wangetal.， 2019)。利用嫁接等系列誘導復幼措施，建立了一套馬尾松成年植株莖芽離體培養(yǎng)技術(Wangetal.， 2017)，實現了馬尾松規(guī)模化組培育苗。

繼代培養(yǎng)是進行外植體馴化，提升繁殖效率，實現大規(guī)模組培苗生產的前提與保障。然而，大量研究表明，在植物長期繼代培養(yǎng)中，營養(yǎng)體出現退化，生長勢差，再生繁殖能力減弱(蘇秀城， 2000； 李淑艷等， 2008； 劉玲梅等， 2008)。自2014年以來，筆者先后建立了257個馬尾松基因型無菌繁殖體系，持續(xù)觀察發(fā)現，經繼代15～20次(1.5～2年)后，繼代芽繁殖效率高，生根效果穩(wěn)定，而繼代時間達4年左右時，繼代芽生根困難，生根率、根條數明顯下降，植株再生效率低，阻礙了馬尾松無性系育苗工廠化。如何解決長期繼代培養(yǎng)造成繁殖效率低(生根能力弱)這一技術瓶頸，探討繼代培養(yǎng)過程中馬尾松不定根發(fā)育的關鍵影響因子尤為重要。以往研究表明，繼代數與植物激素是導致繼代培養(yǎng)中植株再生效率變化差異較大的重要因素(蘇秀城， 2000； 師校欣等， 2007； Huangetal.， 2007)。鑒于此，本文以桐棉松同一基因型不同繼代數繼代芽為研究對象，研究長期連續(xù)繼代培養(yǎng)中馬尾松繼代芽生根能力與內源激素水平的變化，分析內源激素與生根能力的相關性，為揭示馬尾松生根機制，建立高效馬尾松無性育苗技術體系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以優(yōu)良馬尾松地理種源桐棉松為研究對象，采用5株優(yōu)勢木法，在廣西國有派陽山林場15～30年生桐棉松優(yōu)良林分中選優(yōu)。以入選優(yōu)樹當年新抽嫩枝為穗條，半年生馬尾松組培苗為砧木，按常規(guī)方法嫁接。嫁接成活后，去掉嫁接苗頂梢，用500 mg·L-1GA3每隔1周噴施植株促芽萌發(fā)，連續(xù)噴施3～4次。待嫁接苗萌條長至1 cm時，以0.5%尿素每周噴施1次，至萌芽條達3～5 cm長時，于春季晴好天氣采下活力旺盛萌芽條為外植體進行莖芽離體培養(yǎng)。外植體消毒、始芽誘導與繼代培養(yǎng)依照Wang等(2017)方法進行。根據建立的不同基因型無菌繁殖體系的繼代芽增殖系數與生根率，以外植體來源母樹年齡為26年，繁殖效果最穩(wěn)定的基因型GLM-8為試驗對象，繼代周期35～40天，以連續(xù)繼代培養(yǎng)1～40代繼代芽為供試材料。

1.2 繼代芽生根能力觀察

2014—2018年，先后以繼代1、3、5、8、10、15、20、30、40次的繼代芽為試驗材料，根據Wang等(2017)方法，培養(yǎng)基中附加1.2 μmol·L-1萘乙酸(naphthaleneacetic acid，NAA)進行繼代芽不定根誘導。每繼代數來源接種30瓶，每瓶接種4～6株，重復接種試驗5次。生根誘導35天后，待不定根肉眼可見時，統(tǒng)計不同繼代數繼代芽的生根率和長度≥5 mm的不定根數目。其中： 生根率(%)=(生根苗株數÷接種單芽總數)×100，根條數=生根單芽不定根數目總和÷生根苗株數。

1.3 繼代芽內源激素含量測定

測定時間及試驗材料同1.2。激素含量參照Wang等(2019)方法進行測定。

1.4 外源生長調節(jié)劑對繼代芽生根誘導處理

試驗包括3個步驟： 1) 1～40代不同繼代芽生根能力與內源激素相關性分析； 2) 以繼代1代(35～40天)、20代(700～800天)、40代(1 400～1 600天)繼代芽為材料，培養(yǎng)基中添加1.2 μmol·L-1NAA為對照(Control)，1～16 μmol·L-1IAA或多效唑(paclobutrazol，PAC)為試驗處理，觀察繼代芽生根能力變化； 3) 以繼代40代繼代芽為材料，培養(yǎng)基中添加4 μmol·L-1IAA+4 μmol·L-1PAC為處理，以1.2 μmol·L-1NAA為對照，觀察馬尾松生根能力變化。步驟2)、3)中各繼代數每處理接種30瓶，每瓶接種4～6株，重復5次。

1.5 數據分析

利用單因素方差分析(one-way ANOVA，α=0.05)對不同繼代數、激素處理間的均值進行差異顯著性檢驗； 利用線性回歸法分析不同內源激素(IAA、GAs、ABA、ZR)與生根能力(生根率、根條數)的相關關系。為檢驗經長期繼代后馬尾松繼代芽生根能力在對照(NAA)和IAA+PAC處理間是否存在顯著變化，利用T-test(α=0.05和0.01)進行差異顯著性分析。數據處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，用Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 繼代數對繼代芽生根能力的影響

根據前期研究基礎，以26年生桐棉松優(yōu)良林分中入選優(yōu)勢木為繁殖材料，經外植體消毒、始芽誘導、繼代增殖和不定根誘導培養(yǎng)后，篩選繼代增殖能力強(增殖系數5.0～6.7)、生根效果穩(wěn)定(>90%)的基因型GLM-8為研究對象，分別將繼代1～40代的繼代芽接種到1.2 μmol·L-1NAA的生根培養(yǎng)基中，處理35天后對肉眼可見的生根苗及不定根數進行統(tǒng)計(圖1)。

圖1 繼代數對馬尾松繼代芽生根能力影響

繼代數對馬尾松繼代芽生根率和根條數影響顯著。繼代時間≤700～800天時，隨著繼代數增加，生根率和根條數逐漸增加，在繼代數為15～20代時，繼代芽的生根率和根條數最大； 當繼代時間>800天時，繼代芽生根能力明顯下降，其中在繼代1 400～1 600天時，繼代40代繼代芽的生根率(65.7%)和根條數(0.5)最低，與20代繼代芽相比，分別下降了33.4%和92.8%。這說明，一定繼代時間(1.5～2年)范圍內，馬尾松繼代芽生根能力隨著繼代數增加而增強，而后隨著繼代時間延長馬尾松繼代芽生根能力衰退。

2.2 繼代數對繼代芽內源激素水平的影響

圖2 繼代數對馬尾松繼代芽中內源激素水平的影響

繼代過程中，不同繼代數間繼代芽內源激素IAA、GAs、ZR和ABA含量均差異顯著(P<0.05)(圖2)。隨著繼代數增加，各內源激素水平呈不同變化趨勢。其中，IAA先上升后下降，峰值出現在15～20代； GAs在1～20代無明顯變化，30代開始顯著增加，在40代達最高值； ZR呈逐漸上升趨勢，40代時含量最高； ABA水平在1代時最高，之后開始下降，繼代數≥8時，ABA含量無明顯變化。以上結果表明，馬尾松繼代芽中內源激素水平與繼代數密切相關。

2.3 繼代芽內源激素水平與其生根能力相關性分析

線性回歸分析表明，繼代過程中繼代芽內源IAA、GAs、ZR和ABA水平與生根率、不定根條數的線性關系不顯著(R2∶0.01～0.58)。但從線性相關系數大小來看，IAA、GAs與生根能力間相關性大于ZR和ABA。鑒于激素間的互作與協同性，在進一步相關性分析中發(fā)現，IAA/GAs的比值與生根率(R2=0.90)、根條數(R2=0.89)呈顯著正相關的線性關系(圖3)，這一結果表明高濃度IAA、低濃度GAs繼代芽易于生根，低濃度IAA和高濃度GAs具有生根抑制性。

圖3 馬尾松繼代芽生根能力與內源IAA/GAs比值相關性分析

2.4 外源IAA和PAC對繼代芽生根的影響

為揭示IAA與GAs在馬尾松不定根形成中的作用，根據繼代過程中內源激素水平及與生根能力相關性分析結果，選擇生根率、根條數和內源激素水平差異顯著的繼代數(1代： 35～40天； 20代： 700～800天； 40代： 1 400～1 600天)，進行不同濃度外源性IAA或PAC(GA生物合成抑制劑)處理下繼代芽生根能力差異分析。

表1 外源IAA和PAC對不同繼代時間馬尾松繼代芽生根能力的影響①

由表1可知，繼代時間(繼代數)不同，IAA和PAC對馬尾松繼代芽生根的影響也不同。與對照1.2 μmol·L-1NAA處理相比： 繼代35～40天時，4 μmol·L-1IAA顯著提升繼代芽的生根率和根條數，而PAC隨著濃度增加，對繼代芽生能力抑制性增強； 繼代700～800天時，IAA和PAC均對生根率和根條數產生抑制性，且濃度越高，抑制性越強； 繼代1 400～1 600天時，低濃度IAA對生根率的作用不明顯，4 μmol·L-1IAA提高了生根率，但IAA濃度為≥8 μmol·L-1時，對生根率具有抑制性，而IAA對根條數具有明顯的促進性，且隨著濃度增加而增強。對PAC而言，濃度為4 μmol·L-1時，顯著改善了40代繼代芽的生根能力，生根率和根條數分別較對照增加了40.3%和205.3%。由圖4可知，培養(yǎng)中同時添加4 μmol·L-1的IAA和PAC時，繼代40代后馬尾松繼代芽的生根情況。與對照(NAA)相比，IAA+PAC處理下生根率和根條數分別增加49.3%和406.7%。

圖4 不同外源生長調節(jié)劑處理下馬尾松長期繼代芽的生根能力差異

上述研究結果表明，繼代時間影響繼代芽生根能力與內源激素水平，而不同生根能力繼代芽對外源生長調節(jié)劑促根效果的響應也不同。1) 對生根能力中等繼代芽 (繼代35～40天)， IAA作用效果優(yōu)于NAA和PAC。IAA對繼代芽不定根形成具有促進性，且隨著IAA濃度增加不定根條數越多，但高濃度IAA對不定根發(fā)生具有一定抑制性。PAC表現出明顯的抑制性，且濃度越高，繼代芽生根能力顯著下降。2) 對生根能力強繼代芽 (繼代700～800天)： 以NAA作用效果最佳，IAA和PAC均表現出生根抑制性，且濃度越高，抑制作用越明顯。3) 對生根能力弱繼代芽 (繼代1 400～1 600天)： 與NAA相比，IAA主要促進不定根形成，PAC促進了不定根發(fā)生，而高濃度IAA和PAC分別抑制了不定根發(fā)生與形成。利用IAA與PAC交互作用，外源IAA+PAC顯著提升了繼代1 400～1 600天繼代芽的生根能力，其效果明顯優(yōu)于外源IAA或PAC單獨試驗處理。因此，根據不同內源IAA和GAs水平，建議采用不同生長調節(jié)劑，即： 內源IAA、GA水平較低時，以IAA作為生根劑； 內源IAA水平高、GA低，用NAA較為合適； 內源IAA中等，而GA較高時，以IAA+PAC效果最佳。

3 討論

繼代培養(yǎng)時間是影響植株再生能力的一個重要原因。在植物組培繼代培養(yǎng)會產生“馴化”現象，植株的繁殖效率和生根能力增加，但隨著繼代時間延長，繼代培養(yǎng)物出現衰退，表現出生長不良、再生能力下降，甚至喪失形態(tài)發(fā)生能力(劉玲梅等， 2008)。崔德才等(2003)認為，繼代20次后，培養(yǎng)物再生能力下降70%～80%。然而，不同植物由于保持分化潛力的時間不同，差異變化較長。如葡萄(Vitisvinifera)離體培養(yǎng)64代(6年)后，增殖能力未減弱(周萬海等， 2004)。但杉木(Cunninghamialanceolata)(蘇秀城， 2000)、毛葉棗(Ziziphusmauritiana)(續(xù)九如等， 2003)、棉花(Gossypiumhirsutum)(薛美鳳等， 2002)等大部分植物，長期性繼代培養(yǎng)后，植株生根率下降，繁殖能力衰退。本研究馬尾松繼代40次(4年)后，生根能力大幅下降，這與崔德才等(2003)、蘇秀城(2000)等研究結論相同。一般而言，繼代時間在1年以上視為長期繼代(Graneretal.， 2019)。因此，馬尾松成年植株莖芽繼代培養(yǎng)應按長期繼代培養(yǎng)考慮，而為獲得高效、穩(wěn)定的繁殖效果，在馬尾松組培育苗中針對不同培養(yǎng)材料，需進行繼代培養(yǎng)時間(繼代周期、次數)的調整與優(yōu)化。

激素是植物生長和發(fā)育的重要調節(jié)因子，在不定根發(fā)育中起到關鍵性作用(Huangetal.， 2007； Fukakietal.， 2009)。從本試驗繼代芽中內源激素(IAA、GA、ZR和ABA)與生根能力的相關性(R2值)來看，IAA和GA對馬尾松生根的影響較大。應用外源生長調節(jié)劑調控內源IAA、GA水平，分析繼代芽生根率和根條數的變化，能較好反映IAA和GA在馬尾松不定根形成中的作用。外源IAA能顯著增加植株中IAA含量(周宇飛等， 2017； Zhaoetal.， 2019)。本研究中，經外源IAA處理，再生能力衰退嚴重的繼代40次的繼代芽而言，IAA并沒有顯著改善不定根的發(fā)生效果，反而在高濃度(8～16 μmol·L-1)作用下其生根率顯著下降。但IAA卻促進不定根形成，在4～16 μmol·L-1IAA處理下，根條數大幅增加，較對照(1.2 μmol·L-1NAA)增加了5倍左右。該結果與以往研究揭示生長素在根系形成中的促進性作用結論一致(Marhavetal.， 2011； Canoetal.， 2018)。為觀察GA在不定根發(fā)育中的作用，本試驗采用在生根培養(yǎng)中添加了一種被廣泛使用的GA生物合成抑制劑多效唑(PAC)的方法(Watson， 2004； Kamranetal.， 2018)。在4 μmol·L-1PAC作用下，繼代40次繼代芽的生根率和根條數均增加了，這表明GA在馬尾松不定根發(fā)育中的抑制性。然而，高濃度(8～16 μmol·L-1)PAC卻導致了繼代40次繼代芽根條數的減少，則表明GA對不定根形成具有一定促進性。以上結果說明，GA在馬尾松不定根發(fā)育中可能起到促進和(或)抑制性的作用。

GA作用取決于與激素間的交互串擾行為(Mauriatetal.， 2014； Fonouni-Fardeetal.， 2017； Lietal.， 2018)。在本試驗繼代過程中，繼代芽內源激素IAA、ABA、GAs或ZR與生根能力(生根率、根條數)間相關性均不明顯，但IAA/GAs比值與繼代芽生根能力間呈顯著正相關線性關系(R2=0.89～0.90)，說明內源IAA與GA間的平衡調控著馬尾松不定根發(fā)育。生長素(IAA)作為植物離體再生核心激素，所有其他激素對不定根發(fā)育的影響均與IAA有著極大關聯性(Fukakietal.， 2009； Galavotti， 2013)。從IAA與GA間交互作用來看，Fu等(2003)認為，芽苗中GA通過對IAA調節(jié)的響應促進了不定根發(fā)生。本研究中，繼代35～800天時，內源GA水平較低的繼代芽在高濃度PAC作用下，不定根條數顯著減少，說明GA在IAA促進根系形成的作用中具有加效性。而對生根能力差異顯著的繼代20和30次的繼代芽，內源IAA水平無明顯變化，但GA水平顯著上升。初步推測在內源IAA水平相對較高時，GA對不定根發(fā)育主要表現為抑制性。在植物不定根發(fā)生中，一般認為GA對IAA具有增效性，能促進根系的伸長與表達，具有生根促進性。而鈕世輝等(2013)和Mauriat等(2014)認為，在植物不定根原始體誘導分化期，GA通過影響IAA的極性運輸抑制不定根的發(fā)生與徑向生長，具有生根抑制性。本試驗研究結果進一步證實，GA在植物不定根形成中的作用確實存在雙重性，且其作用的具體特性與內源生長素(IAA)水平密切相關。

NAA作為一種類生長素，促根作用強，被廣泛應用于植物組培育苗中。在以往馬尾松組培研究中，NAA對幼態(tài)繁殖材料的促根作用強，生根效果穩(wěn)定(姚瑞玲等， 2016)，但對成熟繁殖材料的促根效果較差(Wangetal.， 2017)。由于繁殖材料生理年齡不同，馬尾松生根能力差異顯著(季孔庶等，1996； Wangetal.， 2019)，說明生根能力不同的繁殖材料對生長調節(jié)劑促根效果的響應可能也不同。本研究以NAA作為對照，生根能力差異顯著的同一基因型繼代芽為試驗材料，證實繼代芽生根能力不同，在不同生根劑(NAA、IAA、PAC)處理下繼代芽生根效果也完全不同。以往研究，馬尾松不定根發(fā)生采用的生根劑類型有NAA、IAA、IBA、ABT(30% IAA、20% NAA)等，其生根效果變化較大(黃健秋等，1994； 姚瑞玲等， 2016； Wangetal., 2017)，這可能與繁殖材料和生根劑類型的匹配度不高有關。馬尾松不定根形成困難，為提高馬尾松生根穩(wěn)定性，根據不同繁殖材料的生理年齡(生長勢)、內源激素水平等特性，應選擇合適的生長調節(jié)劑。此外，本研究針對生長勢減弱、生根能力衰退的長期繼代芽，首次采用PAC作為外源性促根劑，取得了較好的生根效果，這對今后開展馬尾松高效無性育苗技術體系的構建提供參考。

4 結論

本研究分析了馬尾松成年優(yōu)株莖芽長期繼代培養(yǎng)中，繼代芽生根能力、內源激素水平變化及兩者間相關關系。結果表明，繼代培養(yǎng)時間不同繼代芽生根能力也不同，長期繼代培養(yǎng)導致生根能力衰退。繼代培養(yǎng)中繼代芽內源激素水平變化差異較大，其中內源生長素與赤霉素的比值與生根能力密切相關，兩者平衡調控著不定根的發(fā)生與形成。因此，根據繼代芽中不同內源生長素與赤霉素水平，應考慮選擇不同的外源生長調節(jié)劑。