無機鹽與激素混合對土沉香結(jié)香的誘導(dǎo)*

宋曉琛 王西洋 楊 光 黃桂華 周再知 梁坤南 張青青

(1.中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520； 2.江西省林業(yè)科學院 南昌 330032)

土沉香(Aquilariasinensis)，別名白木香，為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)常綠喬木，我國特有藥源植物(中國科學院中國植物志編輯委員會， 1999)，天然分布于海南、廣東、廣西、福建、臺灣等省(區(qū))(康月惠等， 2012)。沉香是沉香屬植物受刺激或損傷后產(chǎn)生的次生代謝物，是傳統(tǒng)的名貴藥材，中醫(yī)認為沉香性微溫，味辛、苦，具有降氣、調(diào)中、暖腎、止痛、肌松之功效，現(xiàn)代研究認為沉香具有降壓、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗心律失常和抑制中樞系統(tǒng)興奮等作用(張爭等， 2010)。沉香亦是名貴的天然香料，富含的揮發(fā)油成分使其香氣濃郁。由于沉香的經(jīng)濟價值高，市場需求量大，20世紀70年代以來，大量掠奪式砍伐采香使土沉香野生資源遭到嚴重破壞，大樹已少見，僅剩零星散生的殘存植株。1999年，土沉香被列為國家二級重點保護野生植物； 2000年，被列入《世界自然保護聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》。當前，隨著沉香市場價格上漲，土沉香人工種植面積不斷增加，但土沉香天然結(jié)香往往需要經(jīng)歷漫長的外部隨機干擾過程，產(chǎn)量低，且不一定結(jié)香。因此，為提高沉香產(chǎn)量，滿足市場需求，人工誘導(dǎo)成為促進土沉香結(jié)香和提高結(jié)香量的有效途徑。

氯化鈉、甲酸或亞硫酸鈉(Thanhetal.， 2015； 王磊等， 2011)、乙烯利、茉莉酸甲酯(MJ)或水楊酸(SA)(Okuderaetal.， 2009； Wijitphan， 2009； 魏建和等， 2010a)均可誘導(dǎo)土沉香結(jié)香。Blanchette等(2009)成功篩選出對沉香屬植物木質(zhì)部活細胞有傷害作用的化學物質(zhì)，包括氯化鈉、亞硫酸氫鈉、氯化亞鐵、氯化鐵、甲酸、甲殼素、酵母提取物、纖維二糖、水楊酸和鐵粉，其將亞硫酸氫鈉、酵母提取物和鐵粉以1∶ 1∶ 3比例混合進行結(jié)香處理，取得較好效果。王磊等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，將pH 1.5～3.0的甲酸、乙酸或磷酸二氫鈉單獨注入白木香木質(zhì)部，誘導(dǎo)12個月時結(jié)香量較少且顏色較淺，而注入甲酸、乙酸或二者混合液與磷酸二氫鈉溶液，則可大面積結(jié)香。王之胤(2013)研究指出，茉莉酸甲酯、乙烯利及其混合液均能誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生脂類物質(zhì)，且相同濃度的混合液處理效果最佳，茉莉酸甲酯次之，乙烯利最差。馬華明(2013)研究表明，氯化鈉和茉莉酸甲酯均可誘導(dǎo)土沉香結(jié)香，但氯化鈉誘導(dǎo)處理沉香醇溶性浸出物含量更高。

目前，無機鹽與激素混合誘導(dǎo)土沉香結(jié)香方面的研究鮮見報道，僅有2項授權(quán)專利(魏建和等， 2010b； 梅文莉等， 2014)介紹了誘導(dǎo)組合及其濃度配方。本研究采用與上述專利不同的無機鹽(NaCl和 FeSO4)和激素(茉莉酸甲酯和乙烯利)濃度并增添CaCl2溶液，對10年生土沉香進行無機鹽與激素混合誘導(dǎo)處理，觀測木芯變色范圍、生理、組織化學及組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物變化，探明無機鹽與激素混合配比對土沉香結(jié)香的影響，揭示其結(jié)香機制，以期為促進土沉香結(jié)香奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗地位于廣東省惠州市博羅縣橫河鎮(zhèn)老圩村(23°N，114°E)，屬亞熱帶季風氣候區(qū)。年均氣溫21.8 ℃，年均降水量1 814 mm，年均日照 2 023 h，1月均溫12.8 ℃，7月均溫28.4 ℃，常年基本無霜。土壤為花崗巖發(fā)育的山地紅壤。10年生土沉香人工林平均胸徑(10.58±0.59) cm，平均樹高(5.82±0.21) m。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設(shè)計 采用均勻試驗設(shè)計，以NaCl、FeSO4、CaCl2、茉莉酸甲酯和乙烯利為誘導(dǎo)因子，每個因子3個水平，共5種處理(表1)，每處理5株小區(qū)，3次重復(fù)，計15株，以注射等量去離子水為對照。2017年7月，選擇晴朗天氣，使用4 mm鉆頭在樹干兩側(cè)距地面30 cm處分別鉆孔，用輸液方式輸入配制好的處理液250 mL。分別在誘導(dǎo)處理后0.5、1、3、6、10個月時，每處理選取3株取樣。

表1 無機鹽與激素組合誘導(dǎo)處理

1.2.2 測定方法 1) 淀粉與可溶性糖含量測定 用內(nèi)徑0.5 cm的生長錐在2個滴注孔上方分別鉆取2根木芯，其中一根除去白木和腐木部分，用球磨儀研磨成粉。分別采用改良的硝酸鈣法和蒽酮-硫酸比色法測定淀粉和可溶性糖含量(魏芳等， 2014)。

2) 切片組織化學觀察 將上述鉆取的另一根木芯置于FAA固定液中，按橫切面和徑切面采用改良的石蠟切片法(蔡海濱等， 2015)固定后，利用萊卡滑動切片機(Leica RM2255,Germany)制作厚度10 μm切片，用蘇丹Ⅲ染色。高清數(shù)碼相機(Pixera Pro 600ES，USA)光學顯微鏡(Olympus BX51，Japan)拍照并觀察切片組織化學變化情況。

3) 組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物觀察 將FAA固定好的木芯依木材三切面(橫切、徑切、弦切)分別制成2 mm厚薄片，放入真空室內(nèi)，用離子濺射儀(JEC-1600，Japan)噴金2次，每次60 s、噴金流30 mA。噴金后，將樣品固定在樣品托鋼柱上，置于掃描電鏡(JSM-6510LV，Japan)中真空掃描，拍照觀察。

4) 木芯變色范圍測定 誘導(dǎo)處理后3、6、10個月時，沿樹干徑向方向，用內(nèi)徑0.5 cm的生長錐在滴注孔上方每隔5 cm鉆取木芯，至木芯全為白木為止。分別測定滴注孔橫向變色深度及孔上縱向變色長度。在滴注孔上方5 cm處取厚度5 cm、半徑3 cm的半圓片，測定橫向變色寬度。

5) 醇溶性浸出物含量測定 分別于處理后6和10個月時，在滴注孔上方5 cm處取5 cm厚半圓片，除去白木和腐木的樣品置于40 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘至恒干，打磨成粉，參照《中國藥典》(中華人民共和國藥典委員會， 2015)采用乙醇熱溶法測定醇溶性浸出物含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理，運用SPSS19.0和DPS(V7.05)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)處理對土沉香淀粉和可溶性糖含量的影響

隨誘導(dǎo)時間增加，各處理淀粉含量先降低后升高(圖1)。處理2在第6個月時淀粉含量降至最低值，而其他處理則在第3個月時降至最低值。當?shù)矸酆拷抵磷畹椭禃r，各處理與對照之間差異顯著，其他時間點差異不顯著。

不同處理下可溶性糖含量變化如圖2所示。處理后0.5～3個月內(nèi)，處理1、3、4和5可溶性糖含量緩慢上升； 第6個月時，這4種處理均達到峰值，但處理5升幅最小，隨后急劇下降。而處理2則表現(xiàn)為第1個月內(nèi)先小幅度降低，后持續(xù)上升，第6個月時達到峰值且高于其他處理。僅在處理6個月時各處理可溶性糖含量顯著高于對照，其他時間點盡管高于對照但差異不顯著。

圖1 不同處理下淀粉含量變化

圖2 不同處理下可溶性糖含量變化

對比淀粉和可溶性糖含量變化發(fā)現(xiàn)，處理2淀粉含量降至最低值和可溶性糖含量升至峰值的時間相同，而其他處理則相對滯后，說明處理2誘導(dǎo)使淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖速度快，新陳代謝能力強，更有利于結(jié)香。

2.2 土沉香切片組織化學變化

經(jīng)染色后，各處理土沉香木芯切片組織內(nèi)油脂類物質(zhì)呈棕黃色(圖3)。處理3個月時，處理2射線薄壁細胞和軸向薄壁細胞內(nèi)含有油脂，其他處理細胞內(nèi)油脂類物質(zhì)幾乎沒有。處理6個月時，處理1、2和3射線薄壁細胞和軸向薄壁細胞內(nèi)油脂類物質(zhì)含量增多，而處理4和5僅有少量油脂類物質(zhì)可見。處理10個月時，各處理射線薄壁細胞和軸向薄壁細胞內(nèi)繼續(xù)積累油脂類物質(zhì)，同時在導(dǎo)管內(nèi)可見。由此可知，油脂先在薄壁細胞內(nèi)形成，隨后在導(dǎo)管和薄壁細胞內(nèi)積累。

圖3 不同處理下油脂染色變化過程

2.3 土沉香組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物變化

未處理前，土沉香莖木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)未見任何形態(tài)內(nèi)含物(圖4A)，但射線薄壁細胞內(nèi)含有大量淀粉粒(圖4B、C)。經(jīng)誘導(dǎo)處理后(以處理2為例)，射線薄壁細胞內(nèi)淀粉粒逐漸消失，木薄壁細胞內(nèi)侵填物質(zhì)開始積累(圖4D)，通過導(dǎo)管-薄壁細胞間半具緣紋孔進入相鄰導(dǎo)管內(nèi)(圖4E、F)，油脂類物質(zhì)或侵填體在導(dǎo)管內(nèi)或傍管薄壁細胞內(nèi)積累至完全堵塞(圖4G-I)。由此可知，結(jié)香過程可能與射線薄壁細胞內(nèi)淀粉粒含量變化有關(guān)。

2.4 誘導(dǎo)處理對木芯變色范圍的影響

2.4.1 橫向變色寬度 不同處理下橫向變色寬度的變化如圖5所示。處理3個月時，各處理間差異顯著，處理2變色寬度最大，是處理1的2.3倍。處理6個月時，處理1、2、3與處理4、5之間差異顯著，處理1變動幅度最大，其橫向變色寬度較處理3個月時增加1倍。處理10個月時，處理2與處理3、4、5之間差異顯著，橫向變色寬度依次為處理2>處理1>處理3>處理4>處理5； 處理2橫向變色寬度達1.73 cm。與處理6個月相比，處理10個月時的橫向變色寬度雖有所增加，但差異不顯著，這表明誘導(dǎo)劑的持續(xù)誘導(dǎo)效果有所下降。CK誘導(dǎo)下土沉香木質(zhì)部始終不變色。

2.4.2 橫向變色深度 由圖6可見，不同誘導(dǎo)處理土沉香橫向變色深度變化趨勢與橫向變色寬度略有不同。處理3個月時，處理4與其他處理之間差異顯著，處理4誘導(dǎo)變色深度最小，只有0.57 cm，說明其誘導(dǎo)作用在前期較差。處理6個月時，處理2、3、4與處理1、5之間差異顯著。與處理3個月相比，除處理5外，其他4種處理差異顯著，其中處理4增幅最大，是3個月時的3.6倍。處理10個月時，處理2與處理3之間差異不顯著，但均顯著高于處理1、4和5； 處理2的橫向變色深度最大，為3.93 cm，是處理6個月的1.64倍，其次為處理3(3.7 cm)和4(2.67 cm)，分別是處理6個月的1.61和1.32倍； 處理5的橫向變色深度最小，只有1.53 cm。處理5處理3、6和10 個月之間橫向變色深度差異不顯著，說明該處理誘導(dǎo)效果不佳。

2.4.3 縱向變色長度 不同處理下縱向變色長度隨時間變化差異顯著(圖7)。處理3個月時，處理3縱向變色長度顯著高于其他處理，處理3的最長(23.67 cm)，處理5的最短(7.67 cm)。處理6個月時，處理2的縱向變色長度顯著高于其他處理。處理10個月時，處理2變色長度最長，縱向變色長度達77 cm，是處理6個月的1.65倍； 處理5變色長度最短，僅45 cm，誘導(dǎo)效果最差。

圖6 不同處理下橫向變色深度的變化

圖7 不同處理下縱向變色長度的變化

2.5 醇溶性浸出物含量及最適配比濃度

不同處理下土沉香醇溶性浸出物含量見表2。處理10個月時，5種處理醇溶性浸出物含量均明顯增加，分別是處理6個月的1.65、1.72、1.24、1.78和1.53倍，且均顯著高于對照。處理2在處理6個月和10個月時醇溶性浸出物含量均最高，分別為11.07%和19.07%，顯著高于其他處理，處理5醇溶性浸出物含量均最低，分別為2.19%和3.36%。

運用DPS(V7.05)多因子逐步回歸分析軟件，分別以變色長度和醇溶性浸出物含量為目標值，建立與5個誘導(dǎo)因子(X1～X5)(因子指代見表1)的相關(guān)回歸方程，以確定誘導(dǎo)因子最適配比濃度。

以處理10個月時的徑向變色長度為目標值(Y1)建立逐步回歸方程(1)，其擬合F=124.636，P=0.000 1，決定系數(shù)=0.988 2，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.984 2。以處理10個月時的醇溶性浸出物含量為目標值(Y2)建立逐步回歸方程(2)，其擬合F=8 181.129 5，P=0.000 1，決定系數(shù)=0.999 8，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.999 8。分別對方程中2個因子進行偏相關(guān)分析，其中X5的P均為0.0001，X1的P分別為0.022 8和0.000 1。

Y1=90.035 9-247.487 2X5-2.646 2X12；

(1)

Y2=22.495 6+2.797 8X1-96.488 9X5。

(2)

由2個回歸方程可知，X1和X5為與因變量密切相關(guān)的主要誘導(dǎo)因子，說明NaCl和乙烯利對誘導(dǎo)土沉香結(jié)香起至關(guān)重要的作用，因X5的回歸系數(shù)絕對值最大，充分說明乙烯利起主導(dǎo)作用。

方程(1)和(2)存在極大值，對其求極大值及其所對應(yīng)的自變量值獲得最適配比濃度，即Y1(max)=76.47 cm和Y2(max)=21.86%時，其最優(yōu)處理組合為0.16%NaCl+0.21%乙烯利。

表2 不同處理下土沉香醇溶性浸出物含量

3 討論

沉香是沉香屬植物受刺激或損傷后產(chǎn)生的次生代謝物。受傷后的土沉香在形成沉香過程中，部分薄壁細胞內(nèi)淀粉消失，使細胞液泡化而處于高滲狀態(tài)，可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢(Nobuchietal.， 1991； 張興麗， 2013； Sawetal.， 2014)。本研究中，隨誘導(dǎo)時間增加，淀粉含量先降低后升高，可溶性糖含量先升高后降低，同時油脂類物質(zhì)不斷積累，與前人研究結(jié)果一致。從淀粉和可溶性糖含量變化可知，土沉香受到脅迫后，淀粉逐漸轉(zhuǎn)化為可溶性糖。從可溶性糖含量升至最高值與淀粉含量降至最低值誘導(dǎo)時間不同可以推斷，可溶性糖含量增加除受淀粉含量和轉(zhuǎn)化速度影響外，還受其他物質(zhì)的影響。處理2中淀粉和可溶性糖含量變化幅度最大，油脂類物質(zhì)積累最多，說明該處理下土沉香的抗逆能力越強，其次生代謝能力也越高。采用可促進土沉香淀粉轉(zhuǎn)化、可溶性糖含量增加的誘導(dǎo)劑，可能更有利于促進次生代謝物積累。

一些闊葉樹當受到機械傷害、真菌侵染和病毒感染時，會產(chǎn)生防御反應(yīng)，在邊材導(dǎo)管中形成創(chuàng)傷性的侵填體和樹膠(Leithetal.， 1999； Sunetal.， 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的土沉香導(dǎo)管內(nèi)未見任何形態(tài)內(nèi)含物，射線薄壁細胞內(nèi)含有大量淀粉粒，為木質(zhì)部的儲藏物質(zhì)； 而經(jīng)誘導(dǎo)處理后，射線薄壁細胞內(nèi)淀粉粒減少，油脂類物質(zhì)或侵填體在木薄壁細胞內(nèi)積累。這些物質(zhì)通過導(dǎo)管-薄壁細胞間半具緣紋孔進入相鄰導(dǎo)管內(nèi)累積、堵塞導(dǎo)管，證實土沉香射線薄壁細胞內(nèi)含物的變化與沉香形成有密切關(guān)系(張興麗等， 2012)的推斷。

乙烯對萜類物質(zhì)的釋放與合成具有調(diào)控作用(劉娟， 2015； Royetal.， 2005)，在高鹽脅迫下，乙烯信號途徑中重要組分參與植物的鹽脅迫反應(yīng)(Leietal.， 2011； 趙赫等， 2016)。乙烯受體對高鹽表現(xiàn)出抗性，其表達量受鹽和乙烯協(xié)同誘導(dǎo)影響(Caoetal.， 2007； Heetal.， 2005)。本研究篩選出對土沉香結(jié)香起關(guān)鍵作用的誘導(dǎo)因子為NaCl和乙烯利，土沉香受鹽脅迫的同時，乙烯利被水解為乙烯，可能啟動乙烯信號途徑，樹體抵御高鹽脅迫能力增強，次生代謝能力提高，從而促進沉香中脂類和倍半萜物質(zhì)積累，與王之胤(2013)研究乙烯利誘導(dǎo)促進土沉香脂類物質(zhì)形成以及Saltveit(2000)研究乙烯作為信號分子對傷害誘導(dǎo)后酚類物質(zhì)合成研究的結(jié)論一致。今后將繼續(xù)設(shè)置試驗，驗證因子理論最優(yōu)組合的實際誘導(dǎo)效果，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計不同濃度乙烯利與NaCl配比混合液試驗，驗證在不同濃度鹽脅迫下乙烯信號分子的響應(yīng)強度，進一步確定對萜類物質(zhì)的合成協(xié)同誘導(dǎo)作用。

激發(fā)子指能誘導(dǎo)植物起防御反應(yīng)的分子，如乙烯、H2O2、水楊酸等，某些金屬離子，如Ca2+、Mg2+等也具有激發(fā)子的功能(Vasconsueloetal.， 2007)。對比本研究中的處理5和4，其差別為是否添加CaCl2或乙烯利。添加CaCl2的處理在第3個月時，木芯橫向變色較快，縱向變色緩慢； 第6和10個月時，木芯橫向與縱向變色幾乎沒有增加； 可溶性糖含量在處理6個月時達到最大值，但升幅最小，油脂類物質(zhì)含量最低。這說明Ca2+可能在誘導(dǎo)結(jié)香初期起作用，誘導(dǎo)結(jié)香效果較差。而添加乙烯利的處理在第3個月時，木芯橫向和縱向變色緩慢，誘導(dǎo)效果不明顯，但在第6和10個月時，木芯變色加快，升幅增大； 升至峰值時，可溶性糖與油脂類物質(zhì)含量相對較高，綜合結(jié)香效果較好。這說明乙烯利可能在后期激活誘導(dǎo)結(jié)香起作用，更能促進結(jié)香。后續(xù)可以繼續(xù)加深Na+、Ca2+和乙烯利之間關(guān)系對沉香結(jié)香影響的研究。

4 結(jié)論

1) 促進土沉香結(jié)香的主要誘導(dǎo)因子為NaCl和乙烯利，其中乙烯利起主導(dǎo)作用，理論上誘導(dǎo)土沉香結(jié)香的最佳因子組合為0.16%NaCl+0.21%乙烯利。

2) 5種誘導(dǎo)處理中，以0.5%NaCl+1.5%FeSO4+0.1%CaCl2+0.01%茉莉酸甲酯+0.05%乙烯利誘導(dǎo)效果最好，處理10個月時醇溶性浸出物含量最高，達19.07%。

3) 結(jié)香油脂先在薄壁細胞內(nèi)形成，隨后在導(dǎo)管和薄壁細胞內(nèi)積累， 導(dǎo)管內(nèi)油脂物質(zhì)積累與薄壁細胞內(nèi)淀粉含量變化有關(guān)， 淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力越強，油脂積累越多，越有利于結(jié)香。