補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方基于線粒體途徑對(duì)RPE 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究

陳強(qiáng)，梁麗娜，莊曾淵

視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE） 細(xì)胞在眼的結(jié)構(gòu)和視覺(jué)功能中起著十分重要的作用。RPE 雖然是色素上皮細(xì)胞，卻具有神經(jīng)細(xì)胞不可再生的特性，一旦死亡只能依靠臨近的RPE細(xì)胞擴(kuò)張和移行填充死亡細(xì)胞占據(jù)的空間[1]。諸多研究[2-3]證實(shí)，RPE 細(xì)胞的損傷或增殖在許多視網(wǎng)膜疾病的病程進(jìn)展中起著重要的作用，它主要參與了年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）等多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，保護(hù)RPE 細(xì)胞正常生理性結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量，抑制RPE 細(xì)胞的損傷變性，已成為治療AMD、RP 等疾病的新方向。課題組前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方對(duì)RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，其作用靶點(diǎn)可能與線粒體有關(guān)。本文擬著重探討補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方基于線粒體途徑對(duì)RPE 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，以揭示其防治AMD 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19 細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。PBS 緩沖液及HBSS 緩沖液（博士德）；氫醌 （Hydroquinone，HQ）（Sigma-Aldrich）；DMEM/F12高糖培養(yǎng)基（HyClone）；0.25%胰蛋白酶消化液（Solarbio）；胎牛血清（Gibco）；TUNEL 檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Roche）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、線粒體/胞漿制備試劑盒 （北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；Cytochrome c Profiling ELISA 試劑盒（abcam）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；SYNERGYTM H1 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin Elmer 公司）；熒光顯微鏡（Leica）。

空白腸吸收液的制備[4]：以不含藥物的臺(tái)氏緩沖液制備得到，儲(chǔ)存在-80℃冰箱備用。補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方含藥腸吸收液的制備：參照文獻(xiàn)[5]制備補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方含藥腸吸收液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后分裝至無(wú)菌Eppendorf 管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RPE 細(xì)胞培養(yǎng)RPE 細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)液，接近融合狀態(tài)時(shí)消化傳代。

1.2.2 HQ 誘導(dǎo)建立RPE 細(xì)胞氧化損傷模型 參照此前方法[5]，以終濃度為90 μM 的HQ 作為造模濃度，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，誘導(dǎo)建立ARPE-19 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞分為正常組：常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組：90 μM 的HQ 作用24 h；空白對(duì)照組（對(duì)照組）：空白腸吸收液干預(yù)24h 后，加入90 μM的HQ 作用24 h；腸吸收液干預(yù)組（干預(yù)組）：補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方含藥腸吸收液干預(yù)24 h 后，加入90 μM 的HQ 作用24 h。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 含藥腸吸收液對(duì)細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞接種于96 孔板，HQ 誘導(dǎo)后采用不同濃度含藥腸吸收液（0.5%、1%、2%、5%）作用24 h 后，棄上清液，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入100 μL DMEM 和10 μL CCK-8 試劑的混合液，37℃孵育3 h 后，采用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值（OD 值）。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率：抑制率（%）=（OD 值正常組－OD 值腸吸收液組）/OD 值正常組×100%。

1.3.2 細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cyt-c）含量的測(cè)定胰酶消化收集各組細(xì)胞，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分離細(xì)胞胞漿成分，經(jīng)過(guò)BCA 法蛋白定量，各樣品調(diào)整為一致的蛋白濃度。采用Cyt-c 定量ELISA 試劑盒測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。樣品經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)后顯色，測(cè)定450 nm 吸光值（OD 值）間接反映樣品中Cyt-c 的含量。

1.3.3 檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開(kāi)放Calcein-AM作為一種敏感的活細(xì)胞染料，可用于檢測(cè)線粒體內(nèi)膜通透性的改變[6]。具體操作如下：胰酶消化收集各組細(xì)胞，進(jìn)行如下操作： 空白對(duì)照管中，加入含鈣HBSS 重懸細(xì)胞；其余各組細(xì)胞分為2 管，加入含鈣HBSS 重懸細(xì)胞后，其中一管加入2 μL Calcein-AM工作液（2 μM），另一管加入2 μL Calcein-AM 工作液（2 μM）和2 μL CoCl2，輕輕混勻后，37℃避光孵育15 min；1000 rpm 離心5 min，棄上清液；用HBSS 洗滌1 次，1000 rpm 離心5 min，棄上清液；加入HBSS輕輕混勻細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)分析： 設(shè)置激發(fā)光488 nm，發(fā)射光為517 nm。

1.3.4 TUNEL 檢測(cè)RPE 細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ARPE-19 細(xì)胞以1.0×106/mL 的濃度接種于預(yù)先放置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置一個(gè)平行復(fù)孔。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，按照TUNEL 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)RPE 凋亡細(xì)胞及RPE 細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/同視野RPE 細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)正態(tài)性分布、方差齊性檢驗(yàn)后，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARPE-19 細(xì)胞形態(tài)

ARPE-19 細(xì)胞鏡下呈現(xiàn)扁梭形、圓形或多角形的細(xì)胞形態(tài)，貼壁良好，胞漿內(nèi)未見(jiàn)明顯黑色素顆粒。不同處理組之間的細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下ARPE-19 細(xì)胞形態(tài)圖。1A 低倍鏡下（×100）；1B 高倍鏡下（×200）

2.2 對(duì)RPE 細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，HQ 誘導(dǎo)后ARPE-19 細(xì)胞活力降低（t=19.466，P=0.000）。與模型組比較，干預(yù)組（濃度分別為1%，2%，5%）RPE 細(xì)胞活力提高（t1%=-4.309，P=0.002；t2%=-9.503，P=0.000；t5%=-4.008，P=0.003），濃度為2%時(shí)細(xì)胞活力最好（表1）。

表1 含藥腸吸收液對(duì)HQ 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞活力的影響（n=6）

2.3 對(duì)RPE 細(xì)胞mPTP 開(kāi)放的影響

與正常組比較，HQ 誘導(dǎo)后的模型組ARPE-19細(xì)胞Calcein 平均熒光強(qiáng)度下降（t=8.398，P=0.000）；與模型組比較，干預(yù)組Calcein 平均熒光強(qiáng)度提高（t=-5.521，P=0.001），對(duì)照組無(wú)明顯變化（t=-0.512，P=0.623）；與對(duì)照組比較，干預(yù)組Calcein 平均熒光強(qiáng)度提高（t=-5.009，P=0.001）（表2）。

2.4 對(duì)RPE 細(xì)胞胞漿Cyt-c 含量變化的影響

ELISA 法分析Cyt-c 含量顯示，與正常組比較，模型組ARPE-19 細(xì)胞胞漿Cyt-c 含量升高（t=-9.987，P=0.000）；與模型組比較，干預(yù)組ARPE-19 細(xì)胞胞漿Cyt-c 含量降低（t=2.968，P=0.018），對(duì)照組無(wú)明顯變化（t=0.251，P=0.808）；與對(duì)照組比較，干預(yù)組Cyt-c 含量降低（t=2.717，P=0.026）（表2）。

表2 含藥腸吸收液對(duì)氧化應(yīng)激損傷ARPE-19 細(xì)胞mPTP開(kāi)放及胞漿Cyt-c 含量變化的影響（，n=3）

表2 含藥腸吸收液對(duì)氧化應(yīng)激損傷ARPE-19 細(xì)胞mPTP開(kāi)放及胞漿Cyt-c 含量變化的影響（，n=3）

注：* 與正常組比較，P<0.05；& 與模型組比較，P<0.05；# 與對(duì)照組比較，P<0.05

2.5 對(duì)RPE 細(xì)胞凋亡的影響

正常組幾乎沒(méi)有凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。與正常組比較，HQ 誘導(dǎo)后模型組可發(fā)現(xiàn)ARPE-19 細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（t=-6.564，P=0.000）。與模型組比較，干預(yù)組ARPE-19 細(xì)胞凋亡率下降（t=2.360，P=0.029），對(duì)照組凋亡率無(wú)明顯變化（t=-0.572，P=0.573）；與對(duì)照組比較，干預(yù)組細(xì)胞凋亡率下降（t=2.932，P=0.008）（圖2、表3）。

表3 含藥腸吸收液對(duì)氧化應(yīng)激損傷ARPE-19 細(xì)胞凋亡的影響（，n=6）

表3 含藥腸吸收液對(duì)氧化應(yīng)激損傷ARPE-19 細(xì)胞凋亡的影響（，n=6）

注：* 與正常組比較，P<0.05；& 與模型組比較，P<0.05；# 與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

圖2 TUNEL 檢測(cè)各組ARPE-19 細(xì)胞凋亡情況圖片（×200）。凋亡細(xì)胞陽(yáng)性呈紅色。2A 正常組；2B 模型組；2C 對(duì)照組；2D 干預(yù)組

AMD 是50 歲以上人群視力喪失的主要病因，伴隨人口老齡化，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[7-8]。雖然目前對(duì)AMD 病因的認(rèn)識(shí)尚不十分清楚，但吸煙已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)為首要危險(xiǎn)因素。香煙中的焦油含有高濃度的氧化劑前體，其中HQ 的含量最高。體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)[9-12]均表明，吸煙或HQ 引起的RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷可能在AMD 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。為此，課題組選擇HQ 為誘導(dǎo)因素造模，通過(guò)建立RPE 細(xì)胞體外氧化損傷模型，探討補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方的作用機(jī)制。

補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方是莊曾淵研究員多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，方藥組成包括枸杞子、淫羊藿、黃芪、石斛等，其中枸杞子、淫羊藿補(bǔ)益腎精，黃芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，石斛滋陰明目，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎養(yǎng)血明目功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能抑制藍(lán)光照射對(duì)體外培養(yǎng)的人RPE 細(xì)胞的損傷作用[13]。淫羊藿苷可以明顯減少糖尿病大鼠心肌膠原含量及心肌線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，高劑量淫羊藿苷明顯抑制了心肌線粒體丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增加了心肌線粒體超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[14]。尾葉遠(yuǎn)志無(wú)論總提取物還是萃取所得各組分，在高濃度時(shí)對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，顯示出較強(qiáng)的抗氧化作用[15]。課題組前期發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方可以增加RPE 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平，減少ROS 的生成，減輕線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）損傷[5]。根據(jù)RPE 細(xì)胞氧化損傷機(jī)制、補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方的組成功效及現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果推測(cè)，補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方很可能通過(guò)線粒體途徑發(fā)揮對(duì)RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，從而阻止或延緩了AMD 的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者探索出了含藥腸吸收液的體外藥理研究方法，模擬復(fù)方的體外吸收過(guò)程，該體系能較好地反映出復(fù)方進(jìn)入體內(nèi)的化學(xué)成分。本研究亦通過(guò)腸吸收液的方法來(lái)觀察補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方的干預(yù)效果，與傳統(tǒng)的含藥血清法相比，該方法不僅去除了復(fù)方的非吸收成分及其他雜質(zhì)，也無(wú)含藥血清的自身內(nèi)源性成分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

HQ 可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，使細(xì)胞活力降低，造成非致死性損傷。本研究表明，補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方腸吸收液可抑制ARPE-19 細(xì)胞損傷，細(xì)胞活性檢測(cè)表明終濃度為2%的含藥腸吸收液保護(hù)效果最好，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用濃度2%的腸吸收液進(jìn)行干預(yù)。

線粒體是真核動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的80%是由線粒體提供的。Cyt-c 是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，是一種相對(duì)分子量為1.45×104的水溶性蛋白質(zhì)，位于線粒體膜間隙，穩(wěn)定地結(jié)合于線粒體內(nèi)膜，不能通過(guò)外膜。本研究的結(jié)果提示RPE 細(xì)胞損傷過(guò)程中Cyt-c 的釋放與線粒體外膜通透性增高有關(guān)。線粒體外膜蛋白聚合形成膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔（permeability transition factor，PTP） 復(fù)合體，PTP 復(fù)合體是一種高電導(dǎo)非選擇性通道，許多因素如Ca2+、氧自由基、pH 改變都可觸發(fā)PTP 開(kāi)放[16]。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ROS 的積累導(dǎo)致線粒體的膜系統(tǒng)受到損害，線粒體外膜通透性增加，跨膜電位降低，使線粒體膜間腔的凋亡蛋白Cyt-c 釋放入細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究的結(jié)果揭示了補(bǔ)腎養(yǎng)血明目方可通過(guò)抑制RPE 細(xì)胞mPTP 開(kāi)放，減少線粒體Cyt-c 的釋放從而減少RPE 細(xì)胞凋亡，線粒體的保護(hù)是其實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用的重要途徑。研究結(jié)果為臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供了理論依據(jù)。