C反應(yīng)球蛋白分析方法的研究進(jìn)展

唐銘擎 毛旭華 龔易昕悅 青琳森 謝靜

摘?要?C反應(yīng)球蛋白（CRP）作為一種重要的急性炎癥與感染性疾病相關(guān)生物標(biāo)志物， 臨床上常被用于多種疾病的評估與病情監(jiān)測。目前， CRP的臨床檢測方法主要有免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附比色法和側(cè)向流免疫層析法等。近年來， 隨著分析理論和材料學(xué)研究的發(fā)展， 生物傳感技術(shù)、微流控技術(shù)等新的分析方法與技術(shù)不斷涌現(xiàn)。本文綜述了CRP的分析方法的開發(fā)與應(yīng)用情況， 重點評述了近五年的最新進(jìn)展， 展望了新型CRP檢測方法的研究方向， 以期為開發(fā)高靈敏度、高特異性、更能滿足臨床需求的CRP分析方法提供參考。

關(guān)鍵詞?C反應(yīng)球蛋白; 診斷; 免疫測定; 生物傳感器; 微流控技術(shù); 即時檢測; 評述

1?引 言

C反應(yīng)球蛋白（C-reactive protein， CRP）是由5個相同亞基以非共價形式結(jié)合而成的五聚體， 是肝細(xì)胞合成的急性期蛋白之一[1]。人體CRP水平在機(jī)體受到感染或損傷時急劇上升， 因此CRP可作為炎癥指標(biāo)， 輔助診斷炎癥相關(guān)性疾病[2]。CRP分析方法改進(jìn)研究也一直是檢驗醫(yī)學(xué)和生物分析化學(xué)領(lǐng)域的熱點研究問題。目前， CRP檢測以免疫分析為主， 其中應(yīng)用最廣泛的有濁度分析法、酶聯(lián)免疫吸附法和側(cè)向流免疫層析法等[3]。隨著分析理論和材料學(xué)研究的發(fā)展， 多種學(xué)科交叉融合， 逐漸涌現(xiàn)出一些新穎的CRP檢測技術(shù)， 如生物傳感技術(shù)、微流控技術(shù)和質(zhì)譜法等。這些新檢測技術(shù)的出現(xiàn)， 滿足了臨床CRP檢測對高靈敏度、寬檢測范圍、即時檢測與多重生物標(biāo)志物檢測的新需求， 為未來進(jìn)一步改進(jìn)CRP分析法提供了新思路。

2?CRP臨床監(jiān)測意義

CRP是人體急性時相蛋白（APP）中最靈敏的反應(yīng)指標(biāo)， 在正常人體內(nèi)含量低， 通常低于10 μg/mL[4]。當(dāng)機(jī)體受到感染或組織損傷時， 血內(nèi)CRP水平可在48 h內(nèi)迅速上升1000倍[2]。因此CRP可作為明確炎癥指標(biāo)， 輔助診斷新生兒敗血癥[5]、膿毒血癥[6]、代謝疾病[7～9]、蕁麻疹[10]、抑郁[11]、腫瘤（除白血病外）[12]等炎癥相關(guān)性疾病的診療工作; 或用于判斷呼吸道感染來源， 避免抗生素的濫用[13， 14]。

手術(shù)后患者易感染并發(fā)癥， 影響血內(nèi)CRP濃度下調(diào)恢復(fù)[2]。因此， 常需連續(xù)監(jiān)測患者CRP水平， 用于判斷患者手術(shù)后是否感染并發(fā)癥[15～18]。研究發(fā)現(xiàn)， CRP能上調(diào)血管損傷因子和多種炎癥因子水平， 參與早期冠心病與粥動脈樣硬化形成機(jī)制[19]。近年的研究也證明， CRP濃度上調(diào)可用于預(yù)測多種心血管疾病發(fā)病率[20～23]。

Ansar等[2]詳細(xì)綜述了血漿CRP濃度與多種疾病發(fā)病進(jìn)程和預(yù)后的相關(guān)性， 充分體現(xiàn)了CRP分析的臨床應(yīng)用價值。

3?CRP分析方法概述

CRP作為存在于血液中的微量蛋白， 受基質(zhì)干擾大， 通過免疫分析可實現(xiàn)其特異性檢測[24]。在識別分子（主要包括CRP特異性抗體、核酸適配體、磷酸酰膽堿、磷酸乙醇胺等）上修飾不同的示蹤材料， 當(dāng)識別分子與樣品中CRP的特異性結(jié)合后， 示蹤材料聚集產(chǎn)生檢測信號， 再直接或聯(lián)用其它檢測技術(shù)讀取檢測信號， 實現(xiàn)對樣品中CRP的定性或定量分析。本節(jié)簡要概述了現(xiàn)有CRP分析方法及其分析特點（表1）。

3.1?經(jīng)典分析方法及其改進(jìn)

經(jīng)典的CRP分析方法有免疫比濁法（Immunoturbidimetry， ITM）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Ezyme linked immunosorbent assay， ELISA）和側(cè)向流免疫層析法（Lateral flow assay， LFA）等。

特異性抗體與靶標(biāo)抗原結(jié)合會形成不溶性免疫復(fù)合物， ITM法利用此時體系產(chǎn)生的濁度變化完成樣品的定性和定量分析。ITM法一般聯(lián)用比濁計讀取濁度信號， 具備方便快捷、檢測范圍寬等優(yōu)點， 是目前臨床工作中最常用的CRP檢測方法之一。ITM法的主要缺陷在于檢測靈敏度低， 為此， 研究者不斷地進(jìn)行了多種方案改進(jìn)。例如， Yang等[25]將光射流激光技術(shù)引入免疫比濁測試， 能有效放大濁度檢測信號， 從而增加檢測靈敏度。

ELISA法是通過酶標(biāo)抗體特異性捕獲靶標(biāo)抗原， 然后利用抗體上的標(biāo)記酶催化底物顯色， 實現(xiàn)樣品比色分析。酶標(biāo)儀配合商業(yè)化的ELISA試劑盒是臨床實驗室CRP測定的主要選擇。雖然ELISA法已廣泛應(yīng)用于臨床樣品檢測， 但仍具有操作步驟繁瑣、耗時長等缺點， Kim等[26]用毛細(xì)管取代傳統(tǒng)微孔板作為固相載體， 無需繁瑣的試劑添加與洗滌工藝， 即可在30 s內(nèi)得到顯色結(jié)果。

LFA法基于層析原理， 使含有CRP的樣品液在纖維素膜毛細(xì)力作用下能快速與檢測線和質(zhì)控線上包埋的標(biāo)記抗體特異性結(jié)合， 隨后通過檢測示蹤材料的聚集產(chǎn)生響應(yīng)信號， 完成樣品液檢測。LFA分析時間短、操作簡便易行， 但經(jīng)典LFA檢測方法檢測范圍狹窄， 一般只能滿足定性檢測要求。為增加檢測靈敏度、實現(xiàn)定量檢測， 研究者通過替換檢測性能更強(qiáng)的示蹤材料[27～30]、去除抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的鉤狀效應(yīng)（Hook effect）[31，32]等方式， 獲得了更寬的檢測范圍與更低的檢出限。

3.2?生物傳感器（Biosensor）

生物傳感器技術(shù)是一種將樣品中CRP濃度轉(zhuǎn)化為物理化學(xué)信號（如電信號、光信號等）的分析技術(shù)， 主要利用識別分子捕獲CRP， 理化換能器（如場效應(yīng)管、壓電晶體等）轉(zhuǎn)化或放大濃度信號， 實現(xiàn)CRP定量分析。生物傳感器技術(shù)形式多變， 現(xiàn)已成為建立新型CRP檢測方案的主要研究方向之一， 根據(jù)檢測原理可將其分為電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器和其它形式的生物傳感器等。

電化學(xué)生物傳感器（圖1A）通過感受檢測體系中電信號變化實現(xiàn)樣品分析。根據(jù)響應(yīng)信號的不同分為安培型和阻抗型兩類。安培型傳感器主要觀測恒定電壓下工作電極的電流變化實現(xiàn)樣品分析[33]， 阻抗型傳感器則是通過檢測電極表面粘附材料的電容、電荷轉(zhuǎn)移電阻或電容變化實現(xiàn)樣品分析[34]。相較于安培型傳感器， 阻抗型傳感器是在小幅正弦電壓下進(jìn)行檢測， 對樣品蛋白與抗體影響小， 可實現(xiàn)無損檢測， 且無需標(biāo)記， 簡單實用。

光學(xué)生物傳感器通過感受檢測體系中單束或多束光的光學(xué)信號變化實現(xiàn)樣品分析。目前， CRP光學(xué)生物傳感器按檢測信號不同可分為五類， 分別為基于評估體系顏色變化的比色型傳感器[36， 37]、基于評估體系發(fā)光信號強(qiáng)度的發(fā)光型傳感器[38， 39]、基于評估體系反射率變化的反射光譜型傳感器[40]、基于評估透射率變化的透射光譜型傳感器[41]和基于評估拉曼散射信號變化的表面增強(qiáng)拉曼光譜型（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）傳感器[35]。其中， SERS是化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)分析中最為敏感的技術(shù)之一（圖1B）。將貴金屬作為傳感器基底， 通過SERS技術(shù)放大拉曼信號， 增強(qiáng)檢測信號強(qiáng)度， 檢出限可降低至5 fg/mL[42]。

除了上述研究較多的電化學(xué)與光學(xué)傳感器外， 還有基于光熱效應(yīng)[43]、光磁效應(yīng)[44]、巨磁阻抗效應(yīng)[45]、壓電效應(yīng)[46]等原理研發(fā)的新型CRP生物傳感器， 以及聯(lián)用SERS檢測技術(shù)與圖像編譯分析技術(shù)的復(fù)合式納米成像傳感器等[47，48]。

3.3?微流控技術(shù)（Microfluidics）

微流控技術(shù)是指利用微機(jī)電系統(tǒng)， 將樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成于微米級的芯片上， 能自動完成免疫分析全過程的分析檢測技術(shù)。相較于經(jīng)典分析方法， 微流控技術(shù)不僅對樣品需求量?。▋H幾微升）、操作便捷快速， 還能實現(xiàn)多種生物標(biāo)志物的同時分析， 是目前臨床體外分析技術(shù)的主要研究熱點。最常見的微流控檢測模式， 以Sinha等[49]建立的場效應(yīng)晶體管微流控技術(shù)為代表。在檢測芯片上集合多個檢測腔室（圖2A）， 每個腔室獨自完成不同生物標(biāo)志物的全分析處理過程（圖2B）， 具備拓展成為多重指標(biāo)分析方法的潛力。Chu等[50]用鋁鎵氮/鎵氮作為微流控芯片基底材料， 能屏蔽生物樣品中的高電解質(zhì)影響， 可直接測定人血清中CRP水平。

3.4?質(zhì)譜法（Mass spectrometry， MS）

質(zhì)譜具備高度靈敏的檢測性能， 能識別分子間微小差異， 實現(xiàn)多種生物標(biāo)志物的同時檢測。例如， Gao等[51]將磁珠與抗體偶聯(lián)使蛋白能快速從樣品液中分離， 以氨基酸標(biāo)記的重組靶蛋白為內(nèi)標(biāo)， 基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜直接分析蛋白質(zhì)含量， 可同時測定包括CRP在內(nèi)的4種生物標(biāo)志物。Ko等[52]結(jié)合免疫分析原理， 以不同金屬摻雜的納米顆粒為示蹤材料，

以電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測信號， 可間接實現(xiàn)多種生物標(biāo)志物的同時測定（圖3）。

上述CRP分析方法的特點見表1?？傮w而言， ITM法檢測范圍寬， 囊括多種病癥， 對應(yīng)CRP臨床檢測范圍， 適用于臨床患者血樣的快速定性檢測。ELISA法靈敏性好且易判讀， 配合使用酶標(biāo)儀， 可用于臨床實驗室中CRP的精密測定。LFA法制備成本低， 但檢測范圍窄， 可用于CRP的定性分析。質(zhì)譜法檢測精密度高， 可實現(xiàn)多重檢測模式， 但檢測設(shè)備對人員素質(zhì)要求高， 不易普及。

基于生物傳感器與微流控技術(shù)的CRP免疫檢測方法形式多變， 且操作簡單， 能兼顧臨床對CRP快速檢測需要與高靈敏檢測需求。其中， 生物傳感器檢測靈敏度最高， 檢出限可低至5 fg/L[35]， 較適合用于超敏CRP（Hypersensitive C-reactive protein， hs-CRP）的臨床分析方法的研發(fā)。 微流控技術(shù)能自動化實現(xiàn)全分析檢測過程， 通過簡單設(shè)備即可精密讀取檢測結(jié)果， 適用于CRP現(xiàn)場快速檢測平臺的開發(fā)。

4?CRP分析方法發(fā)展趨勢

4.1?提高檢測靈敏度

血漿中僅含有微量CRP， 且血漿中蛋白組成復(fù)雜， 除CRP外的無關(guān)蛋白（如白蛋白、γ球蛋白等）有可能黏附在檢測基底表面， 影響檢測基線穩(wěn)定度。受此影響， 如果CRP分析方法檢出限過高， 易造成結(jié)果失真， 甚至出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象， 影響臨床判斷的正確性。因此， 需提高CRP檢測靈敏度， 確保CRP含量的準(zhǔn)確分析。

在降低無關(guān)蛋白的非特異性吸附方面， Hwang等[55]將一種單晶金納米片作為SERS檢測基底， 利用其原子構(gòu)成的平坦表面減少無關(guān)蛋白的非特異性吸附， 使檢測靈敏度提高至10?17 mol/L（圖4A）。

抗體作為識別分子， 其大分子位阻效應(yīng)和不穩(wěn)定的理化性質(zhì)常影響檢測靈敏度。核酸適配體作為一種新型識別分子， 是很好的替代選擇。Wang等[56]以巰基化核酸適配體代替抗體作為識別分子， 降低了識別分子的空間位阻效應(yīng)， 增強(qiáng)了理化穩(wěn)定性， 檢出限降低至1.7 pg/mL（圖4B）。本研究組[57]也利用核酸適配體作為識別分子， 建立了一種新穎的納米酶夾心式ELISA法， 檢出限可低至8 pg/mL。 O′Reilly等[39]采用小分子抗體作為識別分子， 減少了空間位阻與非特異性吸附， 檢出限為0.3 pg/mL。

此外， 增加檢測信號響應(yīng)， 也可提高檢測靈敏度。如Kuo等[58]在電極邊緣添加鋸齒狀結(jié)構(gòu)， 以提高電解質(zhì)電流強(qiáng)度， 檢測靈敏度比傳統(tǒng)電極提高了85.81%（圖4C）。Wang等[59]利用銀介質(zhì)對拉曼信號的增強(qiáng)作用， 在檢測基底表面鍍上一層銀， 放大檢測信號， 使CRP檢出限低至0.01 pg/mL（圖4D）。

4.2?擴(kuò)寬檢測范圍

不同病癥對應(yīng)CRP檢測范圍不同， 實際臨床檢測要求CRP分析法具有較寬的線性檢測范圍。LFA法和一些微流控技術(shù)檢測范圍較窄， 只能實現(xiàn)CRP的定性或半定量檢測， 無法滿足實際臨床檢測需要。為拓寬檢測范圍， 研究者進(jìn)行了多種改進(jìn)方法的研究。

采用檢測信號更強(qiáng)的示蹤材料， 可以拓寬檢測范圍。Hu等[27]制備了一種包含多個量子點的熒光納米球， 將其作為LFA的新示蹤材料， 利用其超強(qiáng)熒光信號使檢測范圍擴(kuò)寬到0.178～11.4 nmol/L。

抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的鉤狀效應(yīng)， 被認(rèn)為是導(dǎo)致免疫分析檢測范圍窄的重要原因。針對鉤狀效應(yīng)對檢測范圍的限制， Oh等[31]在改進(jìn)LFA檢測方法時， 改變樣品墊在試紙條上位置， 控制CRP與捕獲抗體和金標(biāo)抗體間的結(jié)合順序， 減少非特異性結(jié)合產(chǎn)生的鉤狀效應(yīng)， 將檢測范圍拓寬至0.119～100 μg/mL（圖5A）。Rey等[32]直接更換結(jié)果判讀指標(biāo)， 以檢測線與質(zhì)控線檢測信號比值變化曲線為濃度判斷標(biāo)準(zhǔn)， 成功去除了鉤狀效應(yīng)（圖5B）。

在一些分析方法中， 檢測基底無法固定識別分子或識別分子負(fù)載量過低， 導(dǎo)致檢測范圍窄。Lee等[60]利用具有高比表面積和豐富的活性官能團(tuán)的氧化鈦納米纖維墊作為檢測基底， 提高了識別抗體的負(fù)載量， CRP動態(tài)檢測范圍跨越6個數(shù)量級。

4.3?即時檢測

即時檢測（Point of care testing， POCT）是指能在病床旁現(xiàn)場取樣， 并通過便攜式儀器與配套試劑進(jìn)行快速分析的方法統(tǒng)稱。因不需要復(fù)雜樣品處理程序和大型儀器， POCT能大大節(jié)約檢測時間與成本[61]。作為重要的臨床生物標(biāo)志物， CRP的POCT方法開發(fā)是臨床醫(yī)學(xué)和免疫分析領(lǐng)域極具前景的一個發(fā)展方向。

便攜式檢測儀器的研發(fā)， 可降低檢測成本， 簡化操作步驟， 滿足基層醫(yī)療點CRP即時檢測需要。Vashist等[62]用手機(jī)讀取CRP ELISA比色結(jié)果， 底部白光投射使檢測液顏色分布更均勻， 智能手機(jī)攝像頭捕捉圖像后， 用手機(jī)自帶的色彩處理軟件定量描述圖像顏色， 實現(xiàn)比色信號的讀?。▓D6A）。Dong等[63]同樣利用手機(jī)作為檢測儀器， 用其捕捉和分析納米金聚集產(chǎn)生的顏色信號， 實現(xiàn)CRP即時分析。Ji等[64]通過筆式壓力計檢測CRP， 以鉑納米粒子作為示蹤材料， 壓力計讀取鉑納米粒子催化過氧化氫產(chǎn)生的氧氣壓強(qiáng)， 實現(xiàn)CRP檢測（圖6B）。Lin等[65]用可直接讀數(shù)的家用血糖儀實現(xiàn)CRP檢測：CRP與功能化脂質(zhì)體結(jié)合， 釋放包埋其中的淀粉糖苷酶， 使其與Triton X-100直鏈淀粉反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖， 血糖儀分析產(chǎn)生的葡糖糖濃度， 間接計算出CRP含量。

減少繁瑣的樣品預(yù)處理工序與多次洗滌添加過程， 也是POCT的重要研發(fā)策略。Joung等[66]利用不對稱聚砜膜對流體的延遲釋放作用， 研制出可自動化添加二次層析液的LFA檢測方案， 可大大精簡操作步驟， 滿足POCT檢測需求。在此基礎(chǔ)上， 該研究組利用水膨脹聚合物的吸水膨脹原理開發(fā)新型POCT-LFA檢測方案[67]， 可更精準(zhǔn)控制兩次層析液添加間隔時間， 減少檢測方案批間差異性（圖6C）。Tsai等[68]在研發(fā)芯片上增加細(xì)胞過濾膜與過濾柱， 可快速去除血細(xì)胞和大分子量的無關(guān)蛋白， 使該微控流芯片可以不需復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程， 即可進(jìn)行全血檢測（圖6D）。

4.4?多重檢測

目前， 單一指標(biāo)已經(jīng)無法完全滿足臨床精準(zhǔn)診斷需求， CRP常與其它生物標(biāo)志物聯(lián)用， 增加臨床診斷準(zhǔn)確度。因此， 實現(xiàn)樣品的多指標(biāo)同時檢測也是CRP分析的發(fā)展方向。

Qi等[69]在降鈣素原和CRP抗體上標(biāo)記不同量子點， 并設(shè)置兩條不同的檢測線， 開發(fā)了可同時檢測降鈣素原和CRP的LFA（圖7A）。Lv等[70]在血清淀粉樣蛋白A抗體上標(biāo)記紅色量子點、CRP抗體上標(biāo)記綠色量子點， 實現(xiàn)雙蛋白的同時檢測（圖7B）。Sinha等[49]研制出一種場效應(yīng)晶體管微流控芯片， 該芯片有多個檢測腔室， 能同時測定包括CRP在內(nèi)的4種生物標(biāo)志物， 用于臨床心血管疾病發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測分析。Park等[71]研發(fā)的垂直流動檢測技術(shù)， 能控制液體流動順序， 避免測試液間互相干擾， 實現(xiàn)多種生物標(biāo)志物檢測。

5?總結(jié)與展望

CRP作為炎癥與感染指標(biāo)， 可用于多種疾病診斷治療， 具有重要的臨床應(yīng)用價值。隨著材料科學(xué)的進(jìn)步和檢測儀器的多樣化， 新的CRP分析方法不斷涌現(xiàn)， 大大提高了檢測靈敏度，大拓寬了檢測范圍， 滿足了POCT與多重檢測等臨床需求。未來的CRP分析方法研究將重點關(guān)注以下3個方面：（1）現(xiàn)今CRP檢測方法都是以點時間取樣為主， 不適合術(shù)后監(jiān)護(hù)等需要長期監(jiān)測CRP含量的臨床工作。因此， 開發(fā)一種可在體內(nèi)實時連續(xù)監(jiān)測CRP的系統(tǒng)可能是未來CRP分析方法的研究熱點; （2）生物樣品中的無關(guān)蛋白易與檢測基底或識別抗體產(chǎn)生非特異性吸附， 影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。為去除非特異性吸附干擾， 檢測前需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理工作， 不利于臨床CRP的快速檢測。因此， 建立一種能快速去除或削弱無關(guān)蛋白非特異性吸附的檢測技術(shù)， 有助于同時滿足臨床快速檢測和精準(zhǔn)測定需求， 將是未來CRP檢測的研究重點; （3）CRP檢測的重要價值決定了其必將在基層醫(yī)療點被廣泛使用。研制低價便攜的檢測儀器， 降低檢測成本， 也是解決CRP分析法無法在資源稀缺地區(qū)普及的關(guān)鍵。臨床需求決定了CRP分析方法的未來研究方向， 也提示需要繼續(xù)深入改進(jìn)CRP分析方法， 尤其需要分析化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、納米科學(xué)、物理學(xué)等不同學(xué)科之間相互交叉、融合、滲透， 建立以“問題解決”研究為中心的研究方法， 以更好地滿足CRP臨床檢檢測需求。

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