基于陰離子交換策略的自供能生物傳感平臺(tái)超靈敏檢測(cè)肝素

蓋盼盼 孔新珂 趙仕凡 李峰

摘?要?基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，目標(biāo)物濃度直接與生物燃料電池的輸出信號(hào)成比例關(guān)系，因此，自供能生物傳感平臺(tái)具有無(wú)需額外電源、裝置簡(jiǎn)單、利于微型化、抗干擾能力強(qiáng)等突出優(yōu)勢(shì)。但是，生物燃料電池中常用的生物催化劑易失活，導(dǎo)致自供能生物傳感器性能不佳。本研究采用分子印跡多孔金陽(yáng)極為生物陽(yáng)極，實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的選擇性催化，以Fe（CN）63/聚咪唑鎓鹽（Pim）/還原氧化石墨烯復(fù)合物Fe（CN）63/Pim/rGO為生物陰極，構(gòu)建生物燃料電池，集成陰離子交換策略與分子印跡技術(shù)，發(fā)展了一種基于生物燃料電池的自供能生物傳感方法，實(shí)現(xiàn)了肝素（Hep）的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)無(wú)目標(biāo)分子Hep存在時(shí)，基于生物燃料電池的自供能生物傳感器可獲得較高的開(kāi)路電壓與輸出功率;加入Hep后，由于聚合物Pim對(duì)Hep的親和性遠(yuǎn)大于Fe（CN）63，導(dǎo)致Fe（CN）63從復(fù)合物Fe（CN）63/Pim/rGO中釋放，致使生物陰極得電子活性物質(zhì)減少，陰極還原信號(hào)明顯減弱，此時(shí)，開(kāi)路電壓和功率輸出顯著降低?；诖耍赏ㄟ^(guò)檢測(cè)生物燃料電池輸出性能的變化實(shí)現(xiàn)Hep的超靈敏檢測(cè)，檢出限低至0.01 pmol/L，低于目前文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞?生物燃料電池; 分子印跡多孔金; 陰離子交換原理; 肝素; 鐵氰化鉀/聚咪唑鎓鹽/還原氧化石墨烯復(fù)合物; 自供能生物傳感器

1?引 言

基于生物燃料電池（Biofuel cell，BFC）的自供能生物傳感器，目標(biāo)物濃度直接與生物燃料電池的輸出信號(hào)成比例關(guān)系，因此，自供能生物傳感平臺(tái)具有無(wú)需額外電源、裝置簡(jiǎn)單、利于微型化、抗干擾能力強(qiáng)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷、食品分析、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1，2]。Dong等[3，4]基于酶活性、位阻效應(yīng)等實(shí)現(xiàn)了重金屬離子與生物酶的自供能檢測(cè); 也有研究者將生物共軛體與生物燃料電池結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了糖基化產(chǎn)物與抗生素的超靈敏檢測(cè)[5，6]。上述自供能生物傳感平臺(tái)為生化分析及生物傳感提供了新技術(shù)。由于自供能生物傳感方法是基于BFC生物陰陽(yáng)極設(shè)計(jì)，因此，電池輸出性能直接影響傳感器的靈敏度與穩(wěn)定性，尤其是生物來(lái)源的酶的穩(wěn)定性是自供能傳感器穩(wěn)定的前提，但天然酶極易失活[7]。研究發(fā)現(xiàn)，多種納米材料（如MnO2納米片、金納米粒子（AuNPs））等對(duì)葡萄糖具有良好的催化性能，與傳統(tǒng)生物酶相比，納米材料具有合成方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)勢(shì)。因此，基于納米材料構(gòu)建生物燃料電池在穩(wěn)定性與成本方面更具優(yōu)勢(shì)[8]。例如，Lin等[9]的研究表明，修飾于介孔硅表面裸露的AuNPs表現(xiàn)出兩種類(lèi)酶的性能（葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化物酶），既能催化葡萄糖氧化，又能催化過(guò)氧化氫反應(yīng)。但是，AuNPs對(duì)葡萄糖的催化活性受pH值影響較大。相比之下，多孔納米金（NPG）具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，活性幾乎不受外界因素干擾，且穩(wěn)定性更高[10，11]。分子印跡聚合物（MIP）是通過(guò)分子印跡技術(shù)合成對(duì)特定目標(biāo)分子（模板分子）及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物，其中的識(shí)別位點(diǎn)可通過(guò)氫鍵作用、靜電作用、共價(jià)作用等識(shí)別目標(biāo)分子[12]。為增強(qiáng)陽(yáng)極材料對(duì)葡萄糖催化的選擇性，Li等[13]將分子印跡聚合在泡沫鎳表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)堿性環(huán)境中的葡萄糖選擇性檢測(cè)。本研究將MIP引入到多孔納米金中，特異性識(shí)別葡萄糖，并作為生物燃料電池的陽(yáng)極。

將超分子識(shí)別與分析檢測(cè)機(jī)理結(jié)合，發(fā)展新型傳感分析方法，利于拓寬分析目標(biāo)物檢測(cè)范圍; 將超分子識(shí)別與熒光法結(jié)合，可識(shí)別并檢測(cè)各種陰離子物質(zhì)[14]; 將超分子識(shí)別與電化學(xué)方法結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)電化學(xué)惰性分子的安培檢測(cè)。其中，陰離子交換反應(yīng)是利用配位受體實(shí)現(xiàn)陰離子物質(zhì)的識(shí)別與傳感[15]。肝素（Hep）作為一種重要的惰性生物分子，在調(diào)控各種生理病理等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如常見(jiàn)的凝血和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫防御、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等[16]。目前，檢測(cè)Hep的方法主要有熒光法[17～19]、比色法[20]等，但存在靈敏度較差、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。電化學(xué)檢測(cè)法靈敏度高、成本低、效果好，但此類(lèi)研究較少，且強(qiáng)負(fù)電性的電化學(xué)惰性Hep較難檢測(cè)。研究者利用正電性聚合物能與很多陰離子形成離子氫鍵（CH）+···X的屬性，實(shí)現(xiàn)了惰性分子Hep的檢測(cè)[21～23]。

本研究將陰離子交換策略和分子印跡技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了肝素的超靈敏檢測(cè)。自供能生物傳感器由分子印跡納米多孔金（MIP/NPG）的生物陽(yáng)極及Fe（CN）63/聚咪唑鎓鹽（Pim）/還原氧化石墨烯復(fù)合物（Fe（CN）63/Pim/rGO）生物陰極構(gòu)成。在本研究中，MIP/NPG在中性條件下能實(shí)現(xiàn)葡萄糖的有效氧化。MIP/NPG修飾的生物陽(yáng)極構(gòu)建過(guò)程及肝素自供能檢測(cè)原理見(jiàn)圖1。首先，將納米多孔金修飾于ITO表面，然后通過(guò)電聚合的方式將MIP修飾于NPG上（圖1A），洗脫葡萄糖模板分子后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的選擇性檢測(cè)。對(duì)于生物陰極，將帶正電荷的Pim固定到rGO/ITO表面，帶負(fù)電荷的Fe（CN）63通過(guò)靜電作用吸附到Pim/rGO/ITO表面。對(duì)于組裝完成的自供能檢測(cè)體系（圖1B），當(dāng)無(wú)Hep存在時(shí)，陽(yáng)極MIP/NPG催化葡萄糖氧化產(chǎn)生電子，經(jīng)外電路，陰極Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO得電子，產(chǎn)生較強(qiáng)的陰極還原電流與較高的開(kāi)路電壓（EOCV）。當(dāng)Hep存在時(shí)，生物陰極發(fā)生陰離子交換反應(yīng)，Hep吸附到Pim上，導(dǎo)致Fe（CN）63從Pim/rGO/ITO陰極脫離，阻礙了Fe（CN）63的還原過(guò)程，導(dǎo)致生物燃料電池的最大功率輸出（Pmax）和EOCV都明顯降低，從而實(shí)現(xiàn)Hep的超靈敏檢測(cè)。將此自供能生物傳感器用于檢測(cè)實(shí)際血清樣本，結(jié)果令人滿意。本研究構(gòu)建的傳感平臺(tái)在生物體系代謝成分檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JSM-7500F掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）; HT7700 透射電子顯微鏡、CF15RX Ⅱ 離心機(jī)（日本日立公司）; Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）; Autolab PGSTAT 302N電化學(xué)工作站（瑞士萬(wàn)通公司）。

β-D-葡萄糖（日本東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）; 丙烯酰胺、N，N′-亞甲基丙烯酰胺（MBA）、K2SO4、K2S2O8（國(guó)藥控股（上海）化學(xué)試劑有限公司）; 2，2-偶氮異丁腈（AIBN）、Hep、1-乙烯基咪唑和1-氯丁烷（美國(guó)Sigma 公司）; 氧化石墨烯（GO，南京先豐納米材料科技有限公司）。支持電解質(zhì)為Na2HPO4和NaH2PO4配制的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PB，pH 7.4）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)前無(wú)需純化或處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率>18.2 MΩ cm）。

2.2?MIP/NPG生物陽(yáng)極的制備

按照文獻(xiàn)[24]的方法合成NPG，取50 μL NPG滴涂在ITO表面（電極面積為0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥2 h。隨后，通過(guò)自由基聚合法制備MIP，具體步驟為：將100 μL 0.1 mmol/L葡萄糖，加入含42 μmol/L丙烯酰胺、0.4 mol/L K2SO4、10 mmol/L K2S2O8和8.0 mmol/L交聯(lián)劑MBA的5 mL水溶液，充氮?dú)? h后，以NPG/ITO電極為工作電極，采用循環(huán)伏安法（CV，電壓范圍為0.80～1.00 V，掃描速率為100 mV/s）進(jìn)行電聚合，在甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液中洗脫20 min，除去葡萄糖模板分子，將電極置于PB（pH 7.4）中浸泡2 min，即制得MIP/NPG/ITO電極，室溫干燥，備用。

2.3?Pim/rGO/ITO電極的制備

通過(guò)自由基聚合法制備得到Pim[21]，具體步驟為：將[Vbim][Cl]（3.0 g）、AIBN（0.015 g）、氯仿（30 mL）加入到三口燒瓶中，氮?dú)夥諊拢?0℃油浴中混合攪拌反應(yīng)18 h，冷卻到室溫，隨后加入乙醚，形成沉淀，在45℃進(jìn)行旋蒸，獲得的產(chǎn)物在50℃下真空干燥過(guò)夜，于4℃保存，備用。依照文獻(xiàn)[25]的方法采用電化學(xué)方法制備rGO，取60 μL GO溶液（0.38 mg/mL）涂敷在ITO表面（電極面積為0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥1.5 h，采用電化學(xué)還原法制得rGO，電壓范圍為1.5～0.5 V，聚合速率為100 mV/s，電解質(zhì)溶液為0.10 mol/L PB（pH 7.4）。最后，取60 μL制備的Pim溶液滴涂在上述制得的rGO/ITO電極表面，37℃干燥后，制得Pim/rGO/ITO電極。

2.4?Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極的構(gòu)建

將制得的Pim/rGO/ITO電極置于含1 mmol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L PB緩沖溶液中進(jìn)行CV電聚合，電壓范圍為0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s。 將電極取出，在0.10 mol/L PB溶液中，按照上述CV參數(shù)繼續(xù)掃描，直至獲得穩(wěn)定的氧化還原峰，即得到Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極，干燥后備用。

2.5?Hep的自供能生物傳感檢測(cè)

基于MIP/NPG生物陽(yáng)極與Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極，構(gòu)建基于生物燃料電池的自供能傳感平臺(tái)。電解質(zhì)為含5 mmol/L葡萄糖的0.10 mol/L PB（pH 7.4）。首先，測(cè)定BFC的最大EOCV和Pmax。隨后，將Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極浸泡在Hep溶液中，孵育一定時(shí)間后，取出電極，用水沖洗，測(cè)量BFC的開(kāi)路電壓和輸出功率。

3?結(jié)果與討論

3.1?陽(yáng)極材料形貌及催化性能表征

NPG形貌對(duì)葡萄糖催化性能有很大影響。采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)NPG與MIP/NPG的形貌進(jìn)行表征。NPG具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2A），去除模板后的MIP/NPG形貌均一（圖2B）。MIP具有較多活性位點(diǎn)和均一的孔結(jié)構(gòu)，有利于識(shí)別并催化葡萄糖分子。

MIP的存在提高了NPG對(duì)燃料葡萄糖的選擇性，相比于NPG，MIP/NPG是一種更理想的催化劑。本研究考察了MIP/NPG在中性環(huán)境下對(duì)葡萄糖的催化效果。如圖3所示，葡萄糖氧化的初始電位值為0.3 V，隨著葡萄糖濃度遞增，催化電流也逐漸增加。

當(dāng)葡萄糖濃度為0.6 mmol/L、電壓為0.4 V時(shí)，催化電流達(dá)到110 mA，表明陽(yáng)極材料MIP/NPG對(duì)葡萄糖具有優(yōu)異的催化氧化性能。與之前報(bào)道的多孔金納米粒子的催化性能相比[24]，催化電流明顯增大。

3.2?生物陰極材料形貌表征

生物陰極Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO的設(shè)計(jì)是自供能生物傳感檢測(cè)Hep的關(guān)鍵。還原氧化石墨烯（rGO）具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、大的比較面積，不僅可用于固定大量聚合物Pim，還可增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性[25]。采用透射電子掃描顯微鏡（TEM）與SEM對(duì)氧化石墨烯（GO）、rGO的形貌進(jìn)行了表征（圖4A和4C），GO與rGO均為均勻的薄膜狀態(tài)，分散性好。在TEM圖中，合成的Pim呈片狀結(jié)構(gòu)（圖4B），表明成功合成受體Pim。同時(shí)，對(duì)Pim/rGO的形貌進(jìn)行了SEM表征（圖4D），Pim/rGO呈現(xiàn)較好的均勻連續(xù)的褶皺結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)利于Fe（CN）63吸附。

3.3?陰極催化性能表征

采用CVs測(cè)試了陰極的電化學(xué)性能。如圖5A所示，相比于裸ITO電極，Pim/rGO/ITO電極充電電流明顯增加，表明rGO和Pim具有更大的比表面積。

相比之下，F(xiàn)e（CN）63/Pim/rGO/ITO電極有一對(duì)明顯的氧化還原峰，歸因于吸附到電極上的Fe（CN）63在電極表面良好的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。采用微分脈沖伏安法（DPV）對(duì)不同濃度的Hep進(jìn)行檢測(cè)。在含有不同濃度Hep的0.1 mol/L PB緩沖溶液（pH 7.4）中，隨著Hep濃度增大，F(xiàn)e（CN）63/Pim/rGO/ITO電極電流逐漸降低，表明Fe（CN）63在電極表面上的還原反應(yīng)逐漸減弱。這說(shuō)明加入Hep，置換了吸附在Pim膜表面的Fe（CN）63，F(xiàn)e（CN）63濃度降低，生物陰極還原性能明顯減弱。

考察了Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO電極在Hep溶液中的浸泡時(shí)間對(duì)生物陰極還原電流的影響，如圖6所示，當(dāng)Hep濃度為20 pmol/L時(shí)，隨浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，電流降低，浸泡時(shí)間為0.6 min時(shí)，即可以觀察到電流信號(hào)的明顯變化，表明Hep與K3Fe（CN）6之間陰離子交換反應(yīng)速度較快。因此，陰離子交換誘導(dǎo)生物陰極還原電流變化為Hep的定量分析奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)證實(shí)了自供能生物傳感檢測(cè)Hep的可行性。

3.4?BFC性能表征

以Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO為生物陰極，MIP/NPG/ITO為生物陽(yáng)極，構(gòu)建了無(wú)隔膜BFC。在常溫常壓條件下，BFC在含5 mmol/L葡萄糖的PB緩沖液（pH 7.4）中穩(wěn)定運(yùn)行。如圖7A所示，BFC最高EOCV可達(dá)0.78 V，最大電流密度為0.35 mA/cm2，Pmax達(dá)到120 μW/cm2，BFC的功率輸出在20天內(nèi)幾乎保持不變（圖7B），表明所構(gòu)建的BFC具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，為構(gòu)建性能優(yōu)異的自供能生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。

3.5?基于BFC的自供能生物傳感器對(duì)Hep的檢測(cè)

基于所構(gòu)建的生物燃料電池，發(fā)展了自供能生物傳感檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了Hep的檢測(cè)。隨著Hep濃度增大，負(fù)電性更強(qiáng)的Hep置換Fe（CN）63，使其從Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極上脫離，導(dǎo)致生物陰極得電子物質(zhì)減少，信號(hào)減弱，從而影響B(tài)FC功率，輸出Pmax隨之降低（圖8A）。當(dāng)Hep濃度在0.1～100 pmol/L之間時(shí)，Pmax與Hep濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系（圖8B），線性方程為Pmax=52.12-13.87lgCHep（R2=0.9953），檢出限（LOD）為0.01 pmol/L（S/N=3），完全滿足術(shù)后與長(zhǎng)期護(hù)理中臨床相關(guān)監(jiān)測(cè)的要求（1.7～10 μmol/L）[26]。與目前報(bào)道的檢測(cè)Hep的方法相比（表1），本方法具有較低的檢出限與較寬的線性范圍。

3.6?實(shí)際樣品分析

將此自供能生物傳感器用于實(shí)際血清樣品中Hep的檢測(cè)。如表2所示，3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率在925%～102.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）低于3.2%，表明此傳感器具有較好的重現(xiàn)性。更重要的是，此自供能生物傳感器對(duì)Hep的檢出限低至0.01 pmol/L，有望應(yīng)用于臨床診斷中Hep的生物測(cè)定。

4?結(jié) 論

將陰離子交換策略與分子印跡技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了Hep的高靈敏檢測(cè)。Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物陰極中，Pim與Hep之間具有強(qiáng)的親和力，置換出生物陰極中Fe（CN）63，使其脫離電極，生物陰極活性降低，導(dǎo)致BFC輸出功率降低。根據(jù)Pmax信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Hep的高靈敏檢測(cè)，檢出限低至0.01 pmol/L，優(yōu)于目前報(bào)道的檢測(cè)方法。此外，此裝置不需要外部電源供電，傳感設(shè)備簡(jiǎn)單、易于攜帶，便于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究所構(gòu)建的超靈敏、簡(jiǎn)易的自供能生物傳感系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)和生物體系的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

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