原代肝細胞培養(yǎng)與動物實驗對比研究維生素A缺乏對貧血的影響

藍嵐 鄒培斧 梁克紀

摘?要：目的：通過原代大鼠肝細胞培養(yǎng)和動物實驗模型的對比來研究維生素A對貧血的影響。方法：將SD大鼠按體重隨機分為4組，每組13只，分別為Fe+維生素A（Ⅰ組）、Fe+維生素A（Ⅱ組）、Fe+維生素A（Ⅲ組）、Fe+維生素A（Ⅳ組）。實驗動物喂養(yǎng)10周后處死并分離肝臟;原代大鼠肝細胞按Seglent二步消化法分離后，分為嚴重缺乏組（A）、邊緣缺乏組（B）、正常組（C）、治療組（D），依次給予0、0.5、1.0、50 μmol/L 的視黃酸（全反式）培養(yǎng)96 h。用Western-Blot法測量轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）、用ELISA方法測量鐵蛋白（Fn）蛋白的表達，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR法）檢測肝TFR mRNA、Fn mRNA的表達。結(jié)果：當維生素A缺乏時，大鼠肝TFR mRNA表達上調(diào)，使TFR蛋白增加，而Fn mRNA表達下調(diào)，F(xiàn)n蛋白表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：維生素A補給可顯著減輕鐵缺乏造成的利用障礙干擾。

關(guān)鍵詞：維生素A 缺乏;貧血;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體;鐵蛋白

大量臨床觀察研究和研究均證實，維生素A缺乏與鐵代謝有關(guān)，補給維生素A有利于糾正貧血，但對兩者的相互作用原理，特別是維生素A干擾鐵代謝的機制和基礎(chǔ)還沒有闡明[1]。鐵蛋白（Fn）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）作為細胞鐵代謝核心調(diào)節(jié)物，維持鐵的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)上位于非常重要的位置。這種核心調(diào)控作用受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[2]。作為一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，維生素A能夠調(diào)節(jié)儲存器官（肝臟）Fn、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA水平，從而影響鐵利用。本研究通過大鼠動物實驗和原代肝細胞的培養(yǎng)技術(shù)來研究維生素A，為維生素A缺乏加劇貧血提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型膠原、DMEM培養(yǎng)基，均購于公司Gibco BRL，USA;PCR試劑TaKaRa Taq DNA Polymerase Kit，購自大連寶生物工程公司;引物為美國Promega公司、海英駿生物技術(shù)有限公司提供等。

1.2?動物實驗模型

SD大鼠21日齡52只，首先按隨機分組的方法，分為4組后在動物室適應(yīng)喂養(yǎng)1周，按體重隨機分組，每組13只。Ⅰ組：35 mg/kg（Fe）+ 1 200 μg/kg（維生素A）;Ⅱ組：35 mg/kg（Fe）+0 μg/kg（維生素A）;Ⅲ組：35 mg/kg（Fe）+ 120 μg/kg（維生素A）;Ⅳ組：15 mg/kg（Fe）+ 120 μg/kg（維生素A）飼料。單籠喂養(yǎng)10周處死，分離肝臟備用[3]。

1.3?大鼠體外實驗

參照Seglent法[4]消化分離原代肝細胞，將大于90%活力的新鮮分離的肝細胞接種在I型膠原培養(yǎng)板內(nèi)，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，隨機分為：維生素A完全缺乏組（A）：培養(yǎng)液中0.5%DMSO+0%atRA;維生素A邊緣缺乏組（B）：0.5%DMSO+0.5 μmol/L atRA;維生素A正常對照組（C）：1 μmol/L atRA;維生素A治療組（D組）：培養(yǎng)液中0.5%DMSO+50 μmol/L atRA。培養(yǎng)96 h后離心收集肝細胞凍存。用Western-Blot法檢測TFR的蛋白水平，用ELISA方法測量Fn的蛋白水平。

1.4?引物

內(nèi)參照（β-actin）、TFR、Fn引物核酸序列為TFR：ACATGGACAGGAATACGTTC（上游5’→3’）;CAATC-GG ATGCTTTACGTCC（下游5’→3’），F(xiàn)n：GTCTCCCTCGCAAGTGCGCC（上游5’→3’）;下游：TGCATTCAGCCCGCTCTCCC（5’→3’），β-actin：GTGATGGTGGGAATGGGTCAG（上游5’→3’）;TTTGATGTCACGCACGATTTCC（下游5’→3’）;分子量依次為708、250、512。94 ℃預變性4 min，變性30 s，退火為55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，各指標35個循環(huán)。再保持72 ℃ 10 min，4 ℃冰箱儲存[5]。PCR產(chǎn)物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描結(jié)果。

1.5?數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示，采用重復測量資料的方差分析比較多組間區(qū)別，組間的差別比較采用SNK-q檢驗，以α=0.05作為檢驗標準。

2?結(jié)果與分析

2.1?動物實驗結(jié)果

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組結(jié)果比較，TFR mRNA表達上調(diào)，Ⅰ組TFR mRNA的表達最少，F(xiàn)n mRNA的表達趨勢相反（P<0.05）（圖1～7）。

2.2?原代肝細胞培養(yǎng)

隨著維生素A劑量的增加，TFR mRNA表達下調(diào)，TFR蛋白也隨之下降，F(xiàn)n mRNA表達上調(diào)，蛋白水平也隨之上調(diào)（P<0.05）。反之，在肝細胞維生素A缺乏時，TFR mRNA在肝臟表達上調(diào)，而Fn mRNA表達下降，提示在維生素A缺乏時機體通過影響大鼠鐵代謝蛋白的轉(zhuǎn)錄水平的表達，使作為儲存器官的肝細胞從血中攝取鐵增加，釋放減少，導致利用障礙，從而導致貧血的發(fā)生。當補充維生素A可緩解這種改變，肝臟的TFR mRNA表達減少，而Fn mRNA增加，使TFR蛋白表達減少，F(xiàn)n蛋白表達增加，使貧血得到緩解（附表）。

3?討論

大量流行病學、臨床觀察實驗顯示，維生素A缺乏可影響貧血，特別在婦幼人群更為突出[5-7]。維生素A缺乏加劇貧血的主要機制可能與鐵代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)[8]。細胞鐵穩(wěn)態(tài)主要受幾種核心調(diào)節(jié)蛋白所調(diào)控，這些蛋白主要是主導細胞攝取的TFR，完成貯存的Fn和鐵調(diào)節(jié)蛋白（IRP），這些蛋白的表達情況直接影響到細胞鐵穩(wěn)態(tài)的維持，它們共同調(diào)控鐵在細胞內(nèi)的利用，確保在骨髓細胞需要時有鐵供給，同時避免鐵毒性[9-13]。

本研究表明，大鼠維生素A缺乏時，TFR升高，但肝臟Fn降低——這種作用導致肝細胞對鐵的儲存增加，釋放入血減少，從而骨髓利用降低，使貧血加劇。大鼠原代肝細胞培養(yǎng)技術(shù)是保留了肝細胞自身功能又能排除體內(nèi)實驗的干擾的實驗技術(shù)，但實驗中有容易被污染和肝細胞分離后難以貼壁的困難，實驗中要注意實驗動物消毒、無菌操作。原代肝細胞培養(yǎng)時，補充維生素A后這種貧血得以緩解、糾正，但不足之處是維生素A是否影響IRP的活性或通過其他通路還需要進一步研究。本研究對于制定營養(yǎng)干預措施、研制藥物復合制劑防治維生素A和鐵具有指導意義。

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