乳鐵蛋白鐵飽和度對其耐熱性、抑菌作用及抗氧化性的影響

王淑晨，于景華，劉曉輝，駱志剛

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司，北京100600）

0 引 言

乳鐵蛋白（Lf）是一種天然的結(jié)合性球狀糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，具有非常高的等電點[1]，牛乳鐵蛋白的等電點在pH值為8.0左右，人乳鐵蛋白的等電點在p H值為6.0左右。乳鐵蛋白最初是在60多年前作為牛奶中的“紅色蛋白”被發(fā)現(xiàn)的，自1960年首次從母乳和牛奶中提純以來它就已經(jīng)成為強化結(jié)構(gòu)和功能研究的主題[2]。乳制品加工過程中采用的熱殺菌工藝，非常容易導致乳鐵蛋白的變性，所以乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性以及影響其熱穩(wěn)定性的因素成為了乳制品加工行業(yè)關注和研究的熱點。乳鐵蛋白最引人注目的特征就是它具有對鐵非常高的親和力。乳鐵蛋白能夠結(jié)合兩個鐵離子，它對鐵的親和力常數(shù)比轉(zhuǎn)鐵蛋白高300倍，并且由于其基本性質(zhì)，它可以在較低的pH值下保留鐵[3]。因為不同鐵飽和度乳鐵蛋白結(jié)合鐵的能力不同，所以乳鐵蛋白鐵飽和度會對其耐熱性、抑菌作用及抗氧化性產(chǎn)生一定的影響。

1 乳鐵蛋白概況

1.1 乳鐵蛋白的含量

乳鐵蛋白在人乳、牛乳中廣泛存在，在動物體的淚液、唾液、汗液、胰液、膽汁、精液等內(nèi)外分泌液中也存在，但在分泌物中含量甚微，沒有在乳汁中的含量高。它是母乳中第二多的蛋白質(zhì)，含量約占普通母乳蛋白質(zhì)的10%，在初乳中含量為7 g/L，隨著乳汁的成熟乳鐵蛋白的含量會有所下降，在普通乳中占1 g/L左右。牛乳中含有乳鐵蛋白的含量比人乳中要少得多，在中期泌乳期僅為0.1 g/L。另外，在豬、駱駝、馬、水牛、山羊和老鼠等的乳中也能分離到乳鐵蛋白，但商業(yè)上使用的乳鐵蛋白一般是從牛乳中提取的。

1.2 乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

牛乳鐵蛋白是由具有689個氨基酸和4個聚糖的單一多肽鏈組成，分子量為80～84 ku，其多肽鏈上附有兩條碳水化合物側(cè)鏈。碳水化合物的含量為7%左右，組成包括半乳糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖以及涎酸等。乳鐵蛋白折疊成兩個同源的球狀葉，N-葉和C-葉分別代表分子的N-和C-末端。每個葉片由兩個子葉片組成[4]。這些子葉片能夠在碳酸鹽存在下可逆地結(jié)合鐵離子（Fe3+）。乳鐵蛋白能夠以高親和力（KD～10-20M）結(jié)合鐵[5]，但也能夠以較低的親和力結(jié)合許多其他金屬離子。

人乳鐵蛋白與牛乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)相似，氨基酸殘基組成單鏈，兩端折疊成球形（N葉和C葉），中間由一段螺旋肽鏈連接呈現(xiàn)“二枚銀杏葉型”結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白兩葉結(jié)構(gòu)基本相似，不同之處在于表面環(huán)狀葉結(jié)構(gòu)，每葉都有2個相似的α/β區(qū)域，其中一葉基于6束β-層狀結(jié)構(gòu)，另一葉基于5束β-層狀結(jié)構(gòu)。N端和C端的球狀結(jié)構(gòu)包括3個區(qū)域，每端可各與一個鐵離子結(jié)合，此位點位于一個裂口內(nèi)，它與鐵結(jié)合的同時結(jié)合一個CO32-（或2個HCO3-離子），以保持電荷平衡。

1.3 氨基酸序列

牛乳鐵蛋白氨基酸序列是由cDNA序列推定的，人乳鐵蛋白序列是由氨基酸序列測定和cDNA序列推斷得出的。其它哺乳動物如山羊、豬、小鼠等乳鐵蛋白序列也有報道，目前乳鐵蛋白的序列數(shù)據(jù)庫包含來自9種物種的Lf序列：人，小鼠，牛，馬，豬，山羊，綿羊，水牛和駱駝。這些蛋白質(zhì)共享成對同一性，其范圍從最小約65%到接近100%。主要異常值是人類和小鼠的乳鐵蛋白，它們分別與其他的乳鐵蛋白一起顯示70%～74%和65%～70%的同一性[6]。

1.4 生理功能

乳鐵蛋白具有多種生理功能，如促進鐵吸收、促進細胞增殖、調(diào)節(jié)骨髓細胞生成[7]、調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)、刺激溶菌酶再生、防止脂肪氧化等。乳鐵蛋白還可以與許多物質(zhì)以非共價鍵可逆的方式結(jié)合，包括金屬離子、蛋白、細胞以及DNA。具有廣譜抗菌、抗病毒等免疫作用[8]，可作為天然的抗氧化劑，能消炎、抗感染，促進腸道菌群的平衡，并能促進細胞生長和DNA合成，還可抑制癌變[9]。最近還有研究表明乳鐵蛋白在代謝紊亂方面也有一定的作用，如預防肥胖、糖尿病和心血管疾病等[10]。乳鐵蛋白的抗菌作用和抗氧化作用都與乳鐵蛋白能螯合鐵的能力有關，所以在生理功能方面，本文研究了乳鐵蛋白的鐵飽和度對抗菌作用和抗氧化作用的影響。

2 鐵飽和度

乳鐵蛋白的鐵飽和度是指乳鐵蛋白中的鐵與乳鐵蛋白總鐵結(jié)合能力的百分比。乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)呈“二枚銀杏葉型”結(jié)構(gòu)，鐵離子的結(jié)合點位于兩葉的切入部分，乳鐵蛋白的N端和C端可各與一個鐵離子結(jié)合，一分子的乳鐵蛋白可以結(jié)合兩個鐵離子。理論上1 mol乳鐵蛋白結(jié)合2 mol鐵，1 g乳鐵蛋白含有1.4 mg鐵被認為是100%飽和的。乳鐵蛋白粉可以按照乳鐵蛋白鐵飽和度進行分類，鐵飽和度低于5%的乳鐵蛋白被稱為缺鐵乳鐵蛋白（apo-Lf），鐵飽和度高于85%的乳鐵蛋白被稱為鐵飽和乳鐵蛋白（holo-Lf），天然的牛乳鐵蛋白的鐵飽和度為15%左右，人乳鐵蛋白的鐵飽和度為4%左右。

測定乳鐵蛋白鐵飽和度最簡單的方法是基于分光光度測量[11]?？偟鞍踪|(zhì)濃度可以使用280 nm處的吸收系數(shù)來確定，而鐵飽和形式的濃度可以通過使用466 nm處的摩爾吸光系數(shù)來估計。但是應用吸收系數(shù)來計算蛋白質(zhì)濃度僅限于當溶液中僅存在apo或holo形式時的情況。當制劑是兩種形式的混合物時，使用該方法可導致顯著的偏差。為了能更準確的測定乳鐵蛋白中的鐵飽和度，將電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）與Dumas的方法結(jié)合來測定，即使用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定乳鐵蛋白中鐵的含量，使用Dumas的方法來測定出乳鐵蛋白的蛋白質(zhì)含量[12]。乳鐵蛋白的鐵含量還可以用光學發(fā)射光譜或原子吸收光譜技術精確測定，蛋白質(zhì)的含量還可以應用ELISA的方法[13]，使用牛乳鐵蛋白ELISA定量試劑盒來測定乳鐵蛋白的蛋白質(zhì)含量。

3 鐵飽和度對乳鐵蛋白耐熱性的影響

乳鐵蛋白容易受熱失活，牛乳鐵蛋白在pH值為6.6、溫度為65～69℃時開始失活，人乳鐵蛋白在70℃加熱處理15～30 min就已經(jīng)完全失活。目前，差示掃描量熱法（DSC）已被廣泛地用于檢測和監(jiān)測溫度對樣品的熱誘導構(gòu)象和相變。通過差示掃描量熱法研究純化的牛乳鐵蛋白apo-Lf、天然-Lf和holo-Lf3種形式的熱穩(wěn)定性，它們的變性溫度分別為60～66℃、70～73℃、88～92℃。當乳鐵蛋白用鐵飽和時，其最大溫度，起始溫度和變性的焓變化高于其天然形式和apo形式[14]。

乳鐵蛋白中鐵結(jié)合的多少會影響乳鐵蛋白的分子構(gòu)象。與無鐵乳鐵蛋白相比，具有結(jié)合鐵的乳鐵蛋白具有更緊湊的結(jié)構(gòu)，因為在乳鐵蛋白的每個葉中的開放域間裂隙在鐵離子結(jié)合的情況下被封閉。關于葉片結(jié)構(gòu)，C-葉的兩個結(jié)構(gòu)域在鐵部位上比N-葉的結(jié)構(gòu)更封閉，鐵釋放的更快，這導致更高的熱力學穩(wěn)定性，C部位鐵的有效性高于N部位[15]。隨著鐵飽和度的增加，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加。隨后，在研究山羊乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性時也驗證了這一規(guī)律。通過差式掃描量熱法來測定山羊乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白的熱變性溫度[16]，它們的鐵飽和度分別為5%和15%。山羊乳鐵蛋白的熱變性溫度為66℃，牛乳鐵蛋白的熱變性溫度為70℃，牛乳鐵蛋白的鐵飽和度高于山羊乳鐵蛋白的鐵飽和度，牛乳鐵蛋白的熱變性溫度高于山羊乳鐵蛋白的，加熱后，牛乳鐵蛋白比山羊乳鐵蛋白更穩(wěn)定。

通過空間排阻色譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合的方法，來研究鐵飽和度對乳鐵蛋白加熱后熱聚集的影響。Apo-Lf和天然-Lf的熱敏感性比holo-Lf要高，加熱至80℃會形成大的不溶性聚集體，而holo-Lf加熱至80℃時才剛形成可溶性聚集體。Apo-Lf和天然-Lf的熱展開率要高于holo-Lf。乳鐵蛋白的聚集是通過非共價相互作用和游離巰基殘基的分子間硫醇/二硫化物反應的組合進行的。乳鐵蛋白的兩個裂片會在鐵飽和的狀態(tài)下閉合，可以將兩個蛋白質(zhì)裂片核心的非共價位點隱藏起來，減少分子間的相互作用和不溶性聚集體的形成。鐵飽和度也在較高溫度下穩(wěn)定了二硫化物鍵的完整性[17]。鐵飽和度增加了holo-Lf的穩(wěn)定性，從而減少了聚集，增加了蛋白質(zhì)聚合物的溶解度。holo-Lf的更緊湊的構(gòu)造使其在加熱時不會聚集。乳鐵蛋白的聚集取決于鐵飽和度。鐵飽和度越高，加熱時形成的不溶性聚合物就會越少，乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性就越好。

4 鐵飽和度對乳鐵蛋白抗菌作用的影響

Bullen等[18]在1972年首次提出乳鐵蛋白具有抑菌作用。乳鐵蛋白可奪取需鐵細菌所必需的鐵元素，從而抑制其生長。乳鐵蛋白還能與微生物菌體發(fā)生凝集作用，使之死亡。Arnold等[19]通過螢光免疫研究發(fā)現(xiàn)，apo-Lf可與菌體表面結(jié)合，從而隔斷外界營養(yǎng)物質(zhì)進入菌體，致使菌體死亡。現(xiàn)在已經(jīng)確定，乳鐵蛋白屬于廣譜抑菌劑，既可抑制需鐵的革蘭氏陰性菌，如大腸菌群，E.Coli、沙門氏菌、志賀菌等;也可抑制革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌、單細胞李斯特菌等。但對鐵需求不多的微生物，如乳酸菌，則基本不抑制。乳鐵蛋白對變異鏈球菌、霍亂弧菌等有直接致死作用，且與鐵無關。

乳鐵蛋白抑菌效果取決于微生物對鐵的需求程度、外源鐵的生物利用率、乳鐵蛋白的鐵飽和度、鹽類、p H值、抗體或其它免疫物質(zhì)、介質(zhì)等。目前認為乳鐵蛋白抗菌機理可能有以下三個方面：首先，乳鐵蛋白對革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑菌作用是由于乳鐵蛋白高度結(jié)合鐵，使細菌失去生長所需基本元素鐵，乳鐵蛋白鐵飽和度越低，抑菌效果會越好；其次，乳鐵蛋白通過氨基末端強陽離子結(jié)合區(qū)域，增加細菌細胞膜通透性，使細菌脂多糖從外膜滲出，達到直接殺菌作用；另外，乳鐵蛋白可通過水解得到抗菌肽實現(xiàn)抗菌作用。將乳鐵蛋白通過蛋白酶水解獲得一些低分子量，這些肽抗菌活性大幅增強，可抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌的生長[20]。

表1 乳鐵蛋白能抑制的細菌

乳鐵蛋白可以結(jié)合細菌所需的鐵來達到抑菌效果，不同鐵飽和度乳鐵蛋白的結(jié)合鐵的能力不同，鐵飽和度低的乳鐵蛋白結(jié)合鐵的能力要強于鐵飽和度高的乳鐵蛋白。那么隨著鐵飽和度的升高，乳鐵蛋白的抑菌性降低。

5 影響 鐵飽和度對乳鐵蛋白抗氧化作用的

機體內(nèi)氧自由基過剩時，會引起脂質(zhì)的過氧化，損傷細胞和組織的生物膜結(jié)構(gòu)，是衰老或疾病的征兆。Fe3+可以催化產(chǎn)生引起心血管疾病、腸道癌的自由基，游離的Fe3+參與氧自由基反應，聚集在炎癥或受感染部位的Fe3+和Fe2+會催化自由基反應[32]，導致機體出現(xiàn)過多的氧自由基。因此，過量的鐵在機體內(nèi)也會引發(fā)負面影響。乳鐵蛋白能抑制鐵誘導的脂質(zhì)過氧化過程中硫代巴比妥酸和丙二醛的生成。另外，牛乳鐵蛋白還具有核糖核酸酶的活性，能降解酵母中的tRNA，并且還能抑制超氧離子的形成。因此，乳鐵蛋白能夠降低人體內(nèi)自由基對動脈血管壁彈性蛋白的破壞，以達到預防和治療動脈粥樣硬化和冠心病的目的。

Gutteridge等[33]發(fā)現(xiàn)20%鐵飽和度下的乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白在pH7.4的溶液中能抑制鐵催化的牛腦磷脂脂質(zhì)體的脂質(zhì)過氧化，但在這兩種蛋白質(zhì)飽和之后就消除了它們的抑制作用。通過測量氫氧化物（共軛二烯）的形成和氫過氧化物（己醛）的分解來評估乳鐵蛋白作為金屬螯合劑的有效性，發(fā)現(xiàn)天然牛乳鐵蛋白可以在pH 6.6和50℃下抑制了緩沖玉米油乳液和卵磷脂脂質(zhì)體系中的過氧化氫和六氟烷的生成，起到了抗氧化的作用[34]?？寡趸钚噪S著乳鐵蛋白濃度的增加而增加。乳鐵蛋白的抗氧化效果還可以通過分光光度法測定乳鐵蛋白的脂質(zhì)過氧化抑制率、羥自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率來確定。在水包油乳液中，天然乳鐵蛋白和鐵飽和乳鐵蛋白在最初的時候都能起到抗氧化劑的作用，都減少了過氧化物的產(chǎn)生，但是在48 h之后，含有鐵飽和乳鐵蛋白的乳液中產(chǎn)生的過氧化物更多[35]。鐵飽和乳鐵蛋白的抗氧化活性要低于非飽和的乳鐵蛋白。乳鐵蛋白降低吞噬細胞的羥自由基產(chǎn)生，從而抑制了單核細胞膜的鐵催化自動氧化反應。于是，可認為乳鐵蛋白的抗氧化機制主要是螯合了易引起氧化的鐵離子。乳鐵蛋白的抗氧化劑活性取決于脂質(zhì)體系，緩沖液，其濃度，金屬離子的存在和氧化時間。乳鐵蛋白的抗氧化能力會隨著其濃度的增加而升高；通常只要有痕量的鐵或銅等催化劑存在，就會導致氧自由基的產(chǎn)生，因此可以用乳鐵蛋白作為螯合劑來減少自由基的生成量，以此來達到抗氧化的作用，體系中金屬離子的存在會降低乳鐵蛋白的抗氧化能力；隨著氧化時間的增加，乳鐵蛋白的抗氧化能力會逐漸減弱。

乳鐵蛋白可以結(jié)合游離的鐵離子來達到抗氧化的作用，無鐵乳鐵蛋白結(jié)合鐵的能力要強于鐵飽和乳鐵蛋白，無鐵乳鐵蛋白的抗氧化能力是最好的，隨著鐵飽和度的增加，乳鐵蛋白的抗氧化性逐漸減弱。

6 結(jié)語

乳鐵蛋白的鐵飽和度對它的耐熱性、抗菌作用、抗氧化性產(chǎn)生了一定的影響。乳鐵蛋白的分子構(gòu)象隨著鐵與其鐵結(jié)合位點結(jié)合的變化而變化。與無鐵乳鐵蛋白相比，具有結(jié)合鐵的乳鐵蛋白具有更緊湊的結(jié)構(gòu)，因為在乳鐵蛋白的每個葉中的開放域間裂隙在鐵離子結(jié)合的情況下被封閉，所以隨著乳鐵蛋白鐵飽和度的增加，乳鐵蛋白受熱更穩(wěn)定。乳鐵蛋白可以高度結(jié)合鐵離子，使細菌失去所必需的鐵元素而失活，螯合了易引起氧化的鐵離子，所以無鐵乳鐵蛋白的抑菌性要強于鐵飽和的乳鐵蛋白，鐵飽和乳鐵蛋白的抗氧化活性要低于非飽和的乳鐵蛋白。