一種快速檢測乳與乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌的方法

朱海華，譚靜，平洋，周莉，胡桂芳，王法云，王慧，王永

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，鄭州450002）

0 引 言

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)簡稱單增李斯特菌，腸桿菌科李斯特菌菌屬，是目前已知唯一引起人類疾病的李斯特菌屬致病菌[1-2]。單增李斯特菌致病性強，可導(dǎo)致新生兒腦膜炎、敗血癥、孕婦流產(chǎn)和死胎，病死率可達到30%以上[3-6]，被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性致病菌之一[7]。目前，食品中單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢驗方法耗時長、步驟繁瑣，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，危害廣大消費者安全。本文選擇被公認為自然界營養(yǎng)最為均衡的全價食品[8-9]乳與乳制品為研究對象，對樣品中的單增李斯特菌進行富集分離研究，用于單增李斯特菌的快速檢測。該方法操作簡便、耗時短、耗費試劑和培養(yǎng)基少、檢測靈敏度高，大大提高了乳品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限。

1 實驗

1.1 材料

菌株：單增李斯特菌（ATCC 19115），沙門氏菌（CMCC 50115），金黃色葡萄球菌（ATCC 6548），乙型溶血性鏈球菌(CMCC（B）32210)，福氏志賀氏菌（CMCC（B）51572），大腸埃希氏菌（8099），阪崎腸桿菌（ATCC 29544），產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048），銅綠假單胞菌（CMCC 10104），小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（ATCC 23715），由本實驗室傳代保存。

免疫磁珠：單增李斯特菌免疫磁珠，由本實驗室自制。

培養(yǎng)基和試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS），緩沖蛋白胨水，LB肉湯，萘啶酮酸，吖啶黃素，李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基，PALCAM培養(yǎng)基，生化鑒定試劑盒等，dd H2O，碳酸鹽緩沖液，Hanks平衡鹽溶液，混合纖維素（CN-CA）濾膜，聚酰胺類濾膜尼龍（PA-66），聚醚砜（PES）濾膜，聚丙烯（PP）纖維濾膜，具塞平底玻璃杯。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱DPX-9162B-2，立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50，電子分析天平PL202-L，高速離心機UNIVERSAL 320R，旋渦振蕩器，生物安全柜BSC-1500IIB2-X，磁力架，恒溫水浴鍋HH-S，-80℃冰箱700Series，拍擊式均質(zhì)器asyMix，紅外接種環(huán)滅菌器 WM 350，酶標(biāo)分析儀 NM-9602，真空泵P-010，抽濾裝置 1 000 mL，微孔濾膜，移液器（5 000，1 000，200μL）。

2 方 法

2.1 緩沖液的選擇

取10 mL乳與乳制品單增李斯特菌陽性樣品，分別加入裝有90 mL緩沖液的均質(zhì)袋中，均質(zhì)袋中緩沖液分別為：dd H2O，PBS緩沖液（濃度0.02 mol/L，p H值為7.4），碳酸鹽緩沖液，李氏增菌肉湯基礎(chǔ)LB，LB1，LB2，李氏增菌肉湯LB3+0.02 mol/L PBS（體積比1:1）。按照GB 4789.30-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》第一法[10]，對上述菌懸液進行增菌、平板分離、生化鑒定等操作，得出單增李斯特菌陽性菌數(shù)。

2.2 微孔濾膜材質(zhì)和孔徑的選擇

分別選取混合纖維素（CN-CA）濾膜、聚酰胺類濾膜尼龍（PA-66）、聚醚砜（PES）濾膜、聚丙烯（PP）纖維濾膜，經(jīng)過濾器負壓抽濾對比，選擇韌性較好，破損率最低的微孔濾膜用于樣品中目標(biāo)菌的富集。

實驗中分別選取孔徑為0.1，0.22，0.45，0.8，1.2μm的微孔濾膜進行富集效果驗證。無菌條件下取10 mL含單增李斯特菌的乳品陽性樣品，加入裝有90 mL緩沖液的均質(zhì)袋中，經(jīng)離心去除大分子物質(zhì)后，將上清液真空抽濾通過不同孔徑的微孔濾膜，富集目標(biāo)菌于微孔濾膜上，將抽濾后的微孔濾膜取下，洗滌，洗滌后的溶液取1 mL于李斯特氏菌顯色平板，36℃分離培養(yǎng)48 h，計數(shù)李斯特氏菌陽性菌落數(shù)。

2.3 “低溫離心+微孔抽濾”富集法的富集效果驗證

無菌取乳品陽性樣品10 mL，加入盛有90 mL 1∶1的李氏增菌肉湯LB3+0.02 mol/L PBS無菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器均質(zhì)1 min。均質(zhì)液于2℃轉(zhuǎn)速為10 000 r/min低溫離心5 min，采用富集濃縮裝置，0.45μm微孔濾膜抽濾樣液，將微生物富集于微孔濾膜上。將微孔濾膜置于直徑Φ55mm 50 mL具塞平底玻璃杯中，用5 mL洗脫液（含7 mL濃度為0.02 mol/L PBS+3 mL李氏增菌肉湯LB3沖洗浸泡，于微型振蕩器震蕩1 min，制備成目標(biāo)菌樣品濃縮液。分別取1 mL上述樣品濃縮液于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，36℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)單增李斯特菌陽性菌落數(shù)。

2.4 洗脫液的選擇

分別選擇不同種類的洗脫液：10 mL PBS，10 mL LB，7 mL PBS+3 mL LB3沖洗浸泡富集有單增李斯特菌陽性菌的微孔濾膜，得到樣品菌懸液。分別取1 mL上述樣品菌懸液于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，36℃培養(yǎng)48 h，做單增李斯特菌陽性菌計數(shù)，對比不同洗脫液的洗脫效果。

考慮到添加了萘啶酮酸和吖啶黃素后的李氏增菌肉湯有利于單增李斯特菌的分離和保護，因此自制了李氏增菌肉湯LB3并對其洗脫效果進行了研究。

2.5 單增李斯特菌免疫磁珠分離單增李斯特菌敏感性試驗

將單增李斯特菌菌液，按一定梯度進行10倍的倍比稀釋，分別取1 mL對每一濃度梯度進行平板計數(shù)。另取單增李斯特菌免疫磁珠（質(zhì)量濃度5 g/L）50μL，分別加入到0.5 mL的單增李斯特菌稀釋液中，充分混勻后20℃50 r/min振蕩吸附10 min，靜置磁力架上5 min，待磁珠充分被磁力聚集，棄上清，加入1 mL PBS+LB3（7:3）洗滌液，充分混勻，靜置磁力架上8 min，待磁珠充分被吸附，棄上清，重復(fù)洗滌3次，加入1 mL PBS+LB3（7:3）洗滌液震蕩后制備為樣品菌懸液，吸取1 mL菌懸液涂于李斯特氏菌顯色平板，36℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落并計數(shù)單增李斯特菌陽性菌落數(shù)。

2.6 單增李斯特菌免疫磁珠分離單增李斯特菌的特異性試驗

將50μL免疫磁珠，分別加入到0.5 mL單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌中。充分混勻后20℃、50 rpm振蕩吸附10 min，靜置磁力架上5 min，待磁珠充分被磁力聚集，棄上清，加入1 mL PBS+LB3（7:3）溶液，充分混勻，靜置磁力架上8 min，待磁珠充分被吸附，棄上清，重復(fù)洗滌3次，加入1mL PBS+LB3（7:3）溶液震蕩后制備為樣品菌懸液，吸取1 mL涂于營養(yǎng)瓊脂平板，同時直接吸取各菌培養(yǎng)液1 mL涂于營養(yǎng)瓊脂平板，36℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落并計數(shù)單增李斯特菌陽性菌落數(shù)。

2.7 方法驗證試驗

將濃度為1×109mL-1的單增李斯特菌菌液進行10倍梯度稀釋，分別取1 mL稀釋液加入到9 mL的乳與乳制品樣品中，制備成乳與乳制品單增李斯特菌污染陽性樣品。按照本文研究的方法檢測，同時采用《GB 4789.30-2016》第二法[12]

進行檢測對比，檢測乳與乳制品陽性樣品和乳與市售乳制品樣品，對比檢測結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 緩沖液的選擇

不同種類緩沖液對樣品中單增李斯特菌的分離保護效果影響不同，實驗數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 不同緩沖液對單增李斯特菌分離保護效果的影響

由圖1可以看出，雖然李氏增菌肉湯基礎(chǔ)LB，LB1，LB2和濃度0.02 mol/L的PBS溶液均能有效的保護樣品中的單增李斯特菌，其中LB3和濃度0.02 mol/L的PBS的混合液效果最好，分離得到的單增李斯特菌數(shù)最多。因此，選擇體積比1:1的李氏增菌肉湯LB3+0.02 mol/L PBS作為前處理緩沖液最有利于單增李斯特菌的保護。

3.2 微孔濾膜材質(zhì)和孔徑的選擇

經(jīng)過濾器負壓抽濾對比，聚醚砜（PES）濾膜破損率最低。不同孔徑的微孔濾膜對目標(biāo)菌的攔截效果也不同，結(jié)果如表1所示。

表1 微孔濾膜孔徑的選擇

實驗發(fā)現(xiàn)，直徑0.1μm的微孔濾膜過濾時因孔徑太小，過濾速度特別緩慢，10 s后已經(jīng)無法繼續(xù)過濾。直徑0.22μm的微孔濾膜可以過濾大部分的樣品處理液，但是30 s后過濾速度下降，5 min后仍不能過濾完所有樣品溶液。0.45μm、0.8μm、1.2μm的微孔濾膜均可滿足過濾速度要求。但是因為0.8μm和1.2μm的微孔濾膜目標(biāo)菌的富集率偏低，原因可能是單增李斯特菌的大小為0.5μm～2.0μm，孔徑大的微孔濾膜目標(biāo)菌通過濾膜微孔過濾至抽濾瓶中，無法富集所有的目標(biāo)菌。因此，綜合考慮過濾速度、富集效率等因素，采用直徑0.45μm的微孔濾膜富集單增李斯特菌最佳。

3.3 “低溫離心+微孔抽濾”富集法的富集效果驗證

“低溫離心+微孔抽濾”富集法處理樣品后，單增李斯特菌培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法得到的技術(shù)結(jié)果對比數(shù)據(jù)如圖2所示。

由圖2可以看出，低溫離心與微孔濾膜抽濾相結(jié)合富集樣品中的目標(biāo)菌單增李斯特菌較國家標(biāo)準(zhǔn)方法陽性菌的檢出值高，說明該方法富集目標(biāo)菌的效果較好。

3.4 洗脫液的選擇

不同洗脫液的洗脫目標(biāo)菌，并有效保護目標(biāo)菌的效果如表2所示。

圖2 富集效果驗證實驗

表2 不同洗脫液的洗脫效果 mL-1

由表2可看出，僅使用自制李氏增菌肉湯LB3效果并不理想，原因可能是自制李氏增菌肉湯LB3雖然有利于單增李斯特菌的保護和培養(yǎng)，但對于濾膜中的單增李斯特菌洗脫效果并不佳。而選用7 mL濃度0.02 mol/L的PBS溶液和3 mL的LB3的混合溶液，即可以達到洗脫的目的又可以達到保護單增李斯特菌的目的。

3.5 單增李斯特菌免疫磁珠分離單增李斯特菌敏感性實驗

單增李斯特菌免疫磁珠對乳與乳制品中單增李斯特菌的富集分離敏感性實驗結(jié)果如表3所示。

表3 敏感性實驗 mL-1

由表3可見，利用單增李斯特菌免疫磁珠富集分離敏感性可達到10 CFU/mL，直接平板計數(shù)高出2個數(shù)量級，大大提高了單增李斯特菌的檢測靈敏度和檢出限。

3.6 單增李斯特菌免疫磁珠分離單增李斯特菌的特異性試驗

單增李斯特菌免疫磁珠對乳與乳制品中單增李斯特菌的富集分離特異性實驗結(jié)果見表4。

單增李斯特菌（ATCC 19115），沙門氏菌（CMCC 50115），金黃色葡萄球菌（ATCC 6548），乙型溶血性鏈球菌(CMCC（B）32210)，福氏志賀氏菌（CMCC（B）51572），大腸埃希氏菌（8099），阪崎腸桿菌（ATCC 29544），產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048），銅綠假單胞菌（CMCC 10104），小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（ATCC 23715）。

表4 單增李斯特菌免疫磁珠分離單增李斯特菌特異性實驗結(jié)果

經(jīng)單增李斯特菌免疫磁珠富集分離乳與乳制品中的目標(biāo)菌，將富集分離后的樣品待測液進行直接涂布李斯特菌平板，培養(yǎng)后計數(shù)各類陽性菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)平板上的單增李斯特菌菌落較多，其它菌經(jīng)磁珠富集分離后未生長，說明單增李斯特菌免疫磁珠的吸附富集單增李斯特菌特異性良好。

3.7 方法驗證實驗

本文研究的乳與乳制品中單增李斯特菌檢驗方法與國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的陽性樣品及市售樣品檢驗結(jié)果對比如表5所示。

表5 與標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的對比檢驗結(jié)果 mL-1

由表5對比檢驗數(shù)據(jù)可見：（1）本文研究的快速檢驗方法與國標(biāo)方法相比提高了檢測的靈敏度，提高了乳與乳制品中單增李斯特菌的檢出率和檢出限，大大降低了乳與乳制品的食品安全風(fēng)險。（2）該方法縮短了檢測時間，國標(biāo)方法每檢測一個樣品總耗時4～6 d，本發(fā)明的方法每檢測一個樣品總耗時60 min，提高了工作效率。（3）該方法操作簡單，省略了恒溫培養(yǎng)時間和生化鑒定等繁瑣的操作步驟，大大節(jié)省了人力和物力。

4 結(jié) 論

單增李斯特菌作為一種常見的食源性致病菌，在冷藏溫度下仍可生長繁殖，較其他致病菌污染范圍更廣，有“冰箱菌”之稱，由其引起的散發(fā)和暴發(fā)病例主要與即食食品有關(guān)。乳與乳制品作為我國消費較多的即食食品，其安全性不容忽視。因此，提高乳與乳制品中單增李斯特菌的檢測靈敏度和檢出限，可以有效減少市售產(chǎn)品的單增李斯特菌污染率，降低乳與乳制品消費的安全風(fēng)險，保護消費者食用安全。

本文通過對乳與乳制品檢驗時樣品緩沖液的選擇、目標(biāo)菌富集方法的研究、富集后濾膜洗脫液的研究，以及免疫磁珠富集分離單增李斯特菌的敏感性和特異性試驗，建立了一種可以有效提高乳與乳制品中單增李斯特菌檢出限的快速檢測方法。即縮短了檢驗時間和周期，又提高了檢驗的敏感性和靈敏度，可用于乳與乳制品生產(chǎn)企業(yè)對生產(chǎn)環(huán)節(jié)樣品進行單增李斯特菌的實時監(jiān)測，也可用于流通銷售環(huán)節(jié)乳與乳制品的安全性抽查監(jiān)督。