阿爾茨海默病患者皮層金屬離子轉(zhuǎn)運基因的生物信息學特征

汪麟雙 衛(wèi)小蝶 邵玲俐 張俊英 張占軍 李鵬博 孔令竹 徐曉宇 林東飛 衛(wèi)東鋒

(1中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所,北京 100700;2首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院;3北京大學第三醫(yī)院北方院區(qū);北京師范大學 4認知神經(jīng)科學與學習國家重點實驗室;5老年腦健康研究中心;6重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院;7中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所)

阿爾茨海默病(AD),又稱老年性癡呆,是一種與衰老密切相關的神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)主要為漸進性的認知和記憶功能減退、定向不準確、判斷能力喪失、語言表達能力喪失、缺乏邏輯判斷能力、意識模糊、人格分裂和情感改變等認知功能慢性和持續(xù)性障礙〔1〕。目前全世界癡呆患者人數(shù)已高達5 000萬以上,預計2050年將達到1.154億人,其中50%～70%為AD患者。隨著人口老齡化加劇,我國AD患者已超過1 000萬〔2〕。目前AD發(fā)病機制主要包括以下幾種假說,包括:①淀粉樣蛋白-β(Aβ)級聯(lián)假說,認為Aβ寡聚體導致突觸損傷,神經(jīng)元丟失;②Tau蛋白過度磷酸化異常集聚,產(chǎn)生神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT);③金屬離子平衡紊亂假說,認為大腦中的金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白異常表達導致鈣、鐵、銅、鋅等金屬離子在關鍵腦區(qū)分布異常,并引起氧化應激、細胞自噬等,進而損傷神經(jīng)元胞體及軸突;④膽堿能假說;⑤能量代謝紊亂假說〔3〕。AD患者皮層金屬離子代謝紊亂是導致認知功能障礙的重要原因之一。Roy等〔4〕研究表明,AD大腦組織中的金屬離子與Aβ蛋白螯合聚集在老年斑核心及邊緣。AD腦組織中金屬離子代謝紊亂可導致神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體損傷、自噬功能障礙,這些病理又反向加劇金屬離子分布不均及沉積,引起Aβ和Tau蛋白聚集,導致神經(jīng)突觸可塑性降低和神經(jīng)元丟失〔5,6〕。

Mirza等〔7〕研究表明,家族性AD患者腦組織中的鋁含量明顯增多。隊列元分析結(jié)果表明,AD患者腦組織、血清及腦脊液中的鋁含量顯著升高,提高鋁的暴露程度使得AD風險增加71%。Aβ-鋁耦合物可增加大量Aβ寡聚物的生成,并上調(diào)AD相關基因,如淀粉樣前體蛋白(APLP)1和APLP2、微管相關蛋白Tau(MAPT)及β淀粉樣前體蛋白(APP)〔8〕。當銅離子介導氧化還原反應時,也會產(chǎn)生一定的細胞毒性,可能導致神經(jīng)變性〔9〕。目前,基因芯片微陣列技術和生物信息學分析已廣泛應用于組學大數(shù)據(jù)深度挖掘和AD發(fā)病過程的機制研究〔10,11〕。本研究應用基因表達公共數(shù)據(jù)庫(GEO)AD患者皮層中具有明顯差異表達的基因數(shù)據(jù),采用基因本體論GO分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI)等方法進行生物信息學分析,深入探討早期AD患者皮層中與金屬離子代謝相關的差異基因分子功能和蛋白相互作用網(wǎng)絡特征。

1 材料和方法

1.1材料 采集基因芯片數(shù)據(jù),在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“皮層和阿爾茨海默病”為檢索詞,獲得GSE39420、GSE48350和GSE11882基因芯片數(shù)據(jù)。GSE39420為人類后扣帶回區(qū)基因組RNA表達譜,采用商業(yè)化Affymetrix人類外顯子1.1 ST芯片平臺GPL11532進行檢測,該芯片包含了7例AD患者和10例健康對照。GSE48350和GSE11882基因芯片數(shù)據(jù)為人類腦組織基因芯片數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)采用商業(yè)化Affymetrix人類基因組U133 Plus2.0芯片平臺GPL570檢測,GSE48350芯片包含81例AD患者,GSE11882芯片包含63例健康對照。

1.2差異表達基因分析 將GSE39420、GSE48350及GSE11882芯片中共73例正常人作為對照組,88例AD患者作為模型組,應用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)的R語言程序?qū)?個基因芯片數(shù)據(jù)進行分析。AD組與對照組間差異基因的篩選標準為基因表達量變化倍數(shù)|FC|≥1.2且組間差異顯著(P<0.05)。本研究選擇其中的金屬離子轉(zhuǎn)運相關基因進行分析。

1.3差異基因表達蛋白的PPI調(diào)控網(wǎng)絡分析 將30個差異基因表達的蛋白上傳至STRING11.0 PPI-關系在線分析網(wǎng)站(http://www.string-db.org),通過調(diào)節(jié)可信度及附件節(jié)點參數(shù),分析得到差異基因表達蛋白的PPI拓撲網(wǎng)絡圖譜及團簇生物功能分類網(wǎng)絡圖譜。進一步采用Cytoscape3.8.2軟件及Cytohubba插件對調(diào)節(jié)金屬蛋白酶水解和調(diào)節(jié)電壓依賴性鈣通道PPI子網(wǎng)絡蛋白的度值進行分析,并篩選子網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點蛋白。

1.4差異表達基因的基因本體GO富集分析

1.4.1差異表達基因的分類及分子功能分析 將30個差異基因上傳至PANTHER16.0在線分類系統(tǒng)(http://www.pantherdb.org),通過調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)種屬類型及分析類型參數(shù),調(diào)節(jié)結(jié)果展示圖形類別,分別獲得差異基因表達蛋白的分類結(jié)果和分子功能分類結(jié)果,進一步查看各分類中的詳細基因名稱及相關信息,對結(jié)果進行整理。

1.4.2差異表達基因的生物學過程及信號通路分析 在上述數(shù)據(jù)上傳的基礎上,進一步調(diào)節(jié)分析參數(shù)及結(jié)果展示類型,點擊各生物學過程及信號通路分析結(jié)果,查看各生物學過程中所包含的所有基因名稱及其詳細信息,并查看每條信號通路中所涉及的基因數(shù)量、基因名稱等相關信息。

1.5差異基因GO功能簇間的相互作用 將30個差異基因上傳至Metascape在線基因注釋與分析系統(tǒng)(https://metascape.Org/gp/index.html#/main/step1),對基因功能簇間相互作用進行分析,篩選差異基因富集度較高且相似度>0.3的基因功能簇構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡,并篩選重要的基因功能簇。

2 結(jié) 果

2.1差異基因分析 如表1所示,通過組間基因表達分析,從AD患者皮層組織中篩選出30個與金屬離子轉(zhuǎn)運密切相關的差異基因,這些基因的表達均上調(diào)。

表1 AD患者皮層中與金屬離子轉(zhuǎn)運相關的30個差異表達基因

2.2差異基因表達蛋白的PPI拓撲網(wǎng)絡及子網(wǎng)絡蛋白度值 如圖1所示,STRING蛋白相互作用在線分析結(jié)果表明,30個上調(diào)基因表達的蛋白之間存在相互作用關系,網(wǎng)絡中預測的相關功能蛋白為甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶(MUT)、鈣通道電壓依賴性β1蛋白抗體(CACNB1)、鉀離子通道相互作用蛋白(KCNIP)1、KCNIP2、電壓門控性鉀通道E亞家族,成員(KCNE)1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)3、MMP9、電壓依賴性鈣通道γ1亞基(CACNG1)、電壓依賴性鈣通道β2亞基(CACNB2)、MMP1、KCNE2、Discs同源物(DLG)4、N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基(GRIN)2B、GRIN2A、線粒體內(nèi)膜移位酶亞基Tim(TIMM)13。如圖2所示,團簇生物功能網(wǎng)絡分析結(jié)果表明,PPI拓撲網(wǎng)絡中包含3個不同生物功能的子網(wǎng)絡,分別與調(diào)節(jié)金屬蛋白酶水解(紅色)、調(diào)節(jié)電壓依賴性鈣通道(藍色)、介導跨膜蛋白進入線粒體內(nèi)膜(綠色)相關。調(diào)節(jié)金屬蛋白水解子網(wǎng)絡中各節(jié)點蛋白的度值:電壓門控鉀離子通道亞家族D成員(KCND)2(度值10);KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A、GRIN1、DLG4(度值7);電壓門控性鉀通道H亞家族成員(KCNH)2(度值6);KCND3、GRIN3A(度值5);KCNE1、KCNE2、KCNIP1、Disks大同源物關聯(lián)蛋白(DLGAP)1、神經(jīng)突觸黏附樣分子(LRFN)1(度值4);KCND1(度值3);TIMM8A、TIMM23、TIMM10Disks大同源物關聯(lián)蛋白(度值2)。KCND2為該子網(wǎng)絡的中心節(jié)點,度值為10,與子網(wǎng)絡中的其他10個蛋白存在相互作用關系。GRIN1、KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A及DLG4度值為7,為網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點,見圖3。調(diào)節(jié)電壓依賴性鈣通道子網(wǎng)絡中各節(jié)點蛋白的度值:電壓依賴性鈣離子通道蛋白亞基α(CACNA)1C(度值10);電壓依賴性鈣通道γ1亞基(CACNG)1、CACNB2、CACNB1、CACNA2D2、CACNA2D1、CACNA1D(度值6)。瞬時受體電位陽離子通亞家族M成員(TRPM)7、溶質(zhì)載體家族6成員(SLC6A)8、壓力型機械敏感性離子通站道組分(PIEZO)1(度值1)。CACNA1C為該子網(wǎng)絡的中心節(jié)點,度值為7,與子網(wǎng)絡中的其他7個蛋白存在相互作用關系,CACNB2,CACNA2D1、CACNA1D、CACNB1、CACNA2D2和CACNG1度值均為6,為網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點,見圖3。刪除這些關鍵節(jié)點,則網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)渙散。這些子網(wǎng)絡關鍵節(jié)點的基因表達量見表2,其中GRIN2B、GRIN1、CACNB2、DLG4的變化倍數(shù)較大。

2.3差異基因的GO分類 差異基因的GO分析結(jié)果包括基因表達蛋白的分類(蛋白總數(shù)30,分類匹配數(shù)目18)、分子功能(匹配數(shù)目24)、生物學過程(匹配數(shù)目30)及信號通路(匹配數(shù)目6)。

2.3.1差異基因表達蛋白的分類和分子功能分析 PANTHER系統(tǒng)蛋白分類結(jié)果表明,差異基因表達的蛋白可分為4個類別,包括基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、蛋白結(jié)合活性調(diào)節(jié)因子、跨膜信號受體及轉(zhuǎn)運蛋白,每種類別包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。分子功能分析結(jié)果表明,差異基因的分子功能可分為4個類別,包括結(jié)合活性、催化活性、分子傳導及轉(zhuǎn)運活性,每種分子功能包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。

圖1 差異基因表達蛋白的PPI拓撲網(wǎng)絡

圖2 差異基因表達蛋白的相互作用團簇圖

網(wǎng)絡拓撲圖中代表蛋白的圓形節(jié)點面積、顏色深度與其相關性度值呈正相關圖3 子網(wǎng)絡度值

表2 網(wǎng)絡關鍵節(jié)點蛋白的基因表達信號值

2.3.2差異基因的生物學過程和信號通路分析 PANTHER系統(tǒng)生物學過程分類結(jié)果表明,差異基因的生物學過程可分生物調(diào)節(jié)過程、細胞過程、定位過程及代謝過程,每種生物學過程包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。差異基因主要涉及腎上腺素和去甲腎上腺素的生物合成信號通路、α腎上腺素能受體信號通路、離子型谷氨酸受體信號通路、毒蕈堿型乙酰膽堿受體2和4信號通路及煙堿乙酰膽堿受體信號傳導信號通路,每條信號通路包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。

表3 差異基因表達蛋白的分類和分子功能及生物學過程和信號通路

2.4差異基因GO功能簇間的相互作用分析 如圖4所示,Metascape在線分析系統(tǒng)富集得到差異基因功能簇之間的相互作用網(wǎng)絡圖,其中富集程度較高的GO基因功能簇包括無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運、離子穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)、陰離子轉(zhuǎn)運、膜電位調(diào)節(jié)及溶質(zhì)載體介導的跨膜轉(zhuǎn)運。功能簇間的相互作用分析結(jié)果表明,神經(jīng)元系統(tǒng)、膜電位調(diào)節(jié)、細胞離子穩(wěn)態(tài)、小分子轉(zhuǎn)運及細胞金屬離子穩(wěn)態(tài)與多個基因功能簇之間具有相互作用關系。

3 討 論

研究表明,腦組織中金屬離子穩(wěn)態(tài)在維持腦的正常生理功能和認知功能方面具有非常重要的作用。部分細胞跨膜轉(zhuǎn)運體、金屬離子調(diào)節(jié)因子及金屬離子伴侶蛋白能夠保護和引導金屬離子到達目的地〔12,13〕。腦內(nèi)金屬離子轉(zhuǎn)運體異?？芍苯踊蜷g接地影響多種細胞途徑,加重金屬離子轉(zhuǎn)運和沉積異常。AD患者腦組織中金屬離子代謝紊亂是導致神經(jīng)網(wǎng)絡失連接和認知功能障礙的主要原因之一〔14,15〕。金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白、傳感因子及其伴侶蛋白表達異常可引起腦組織中金屬離子代謝障礙,而金屬離子失衡可加速Aβ沉積和磷酸化Tau蛋白聚集,導致NFT、神經(jīng)元丟失、突觸可塑性降低,進而導致AD的發(fā)生和發(fā)展。

AD患者腦內(nèi)鐵、銅、鋅、鈣等金屬離子在不同腦區(qū)過量沉積,導致老年斑生成增多〔16,17〕。金屬離子在大腦內(nèi)錯誤沉積導致氧化應激,而離子失衡與氧化應激可通過激活β-或γ-分泌酶、抑制α-分泌酶,協(xié)同或獨立地促進Aβ過量產(chǎn)生〔18,19〕。載脂蛋白(Apo)E4基因是AD的危險因素〔20〕,微量金屬離子和一氧化氮含量異常會影響ApoE4基因的表達,導致AD患病率上升〔21,22〕。相關研究表明〔23,24〕,AD患者腦內(nèi)多種鐵代謝相關蛋白表達異常會導致腦內(nèi)鐵沉積,促使氧自由基生成,加重腦組織的氧化應激損傷。本研究中的皮層基因數(shù)據(jù)來源于AD患者皮層組織,篩選出的差異基因與皮層組織中金屬離子代謝紊亂密切相關,包括電壓依賴性鈣離子通道亞基α2/δ1(CACNA2D1)、N-甲基-D-天冬氨酸離子能谷氨酸受體1、壓力型機械敏感性離子通道組分1、瞬時受體電位陽離子通道亞家族M,成員7、溶質(zhì)載體家族6,成員8、鋅指蛋白318等。STRING分析結(jié)果表明,AD患者皮層中與離子轉(zhuǎn)運相關的差異基因表達的蛋白之間存在相互作用關系,PPI網(wǎng)絡中包含7個關鍵節(jié)點蛋白,分別為CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、電壓門控鉀離子通道亞家族D(KCND)3、電壓門控鉀離子通道亞家族(KCN)Q1及KCNQ5。

溶質(zhì)載體基因表達的溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運蛋白是哺乳動物細胞膜蛋白的主要亞群之一,包括400多種跨膜溶質(zhì)載體。這些膜蛋白利用H+與Na+梯度作為動力,將血液中的底物逆濃度梯度運輸?shù)侥X細胞內(nèi)部,滿足大腦對能量和營養(yǎng)的較高需求〔25〕。本研究中篩選出12個溶質(zhì)載體家族基因,占所有差異基因的25%。溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運蛋白在神經(jīng)退行性疾病中起著重要作用,可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素在突觸區(qū)域的濃度〔26〕。其中,溶質(zhì)載體家族(SLC)6也被稱為神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運體,可維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA、甘氨酸與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸之間的平衡〔27〕。

鋅指蛋白(ZNF)家族是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族,具有多種生物學功能。單倍型區(qū)塊定量性狀分析結(jié)果表明,ZNF827的單倍型區(qū)塊與腦脊液中Aβ42的濃度相關。研究表明,ZNF突變體可對認知功能和神經(jīng)影像學表型產(chǎn)生重要影響,如ZNF804A基因與額、顳葉灰質(zhì)密度降低導致的認知障礙患者的認知功能損傷密切相關,能夠影響神經(jīng)突起生長、突觸形成和多巴胺能傳遞相關基因的表達水平,在神經(jīng)遷移、軸突生長和突觸形成等過程中發(fā)揮重要作用〔28,29〕。本研究差異基因的生物信息學分析結(jié)果表明,AD患者皮層中的金屬離子轉(zhuǎn)運相關差異基因主要涉及結(jié)合活性、催化活性、分子傳導及轉(zhuǎn)運活性,通過調(diào)節(jié)α腎上腺素能受體、離子型谷氨酸受體、毒蕈堿型乙酰膽堿受體、煙堿乙酰膽堿受體信號傳導信號通路參與生物調(diào)節(jié)、細胞過程、定位過程及代謝生物學過程,為早期AD研究提供了新思路和防治靶標。

綜上,應用生物信息學和相關性分析方法對AD患者皮層組織中金屬離子轉(zhuǎn)運基因進行了深入分析,篩選出了7個重要調(diào)節(jié)基因,分別為CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、KCND3、KCNQ1和KCNQ5,以離子型谷氨酸受體信號通路為主,針對這些差異基因及其表達的蛋白進行深入研究,將有助于進一步揭示皮層金屬離子轉(zhuǎn)運基因在AD早期階段的重要作用,并為AD的早期篩查和靶向治療提供科學依據(jù)。