豬附紅細(xì)胞體eno 基因可視化LAMP 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

金麗蘭，付兢鋒，馬浩原，王靜璇，李長(zhǎng)春，薛書江，高 旭*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133000；2.敦化市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，吉林 敦化 133700）

豬附紅細(xì)胞體?。≒orcine eperythrozoonosis，PE）是由豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis，M. suis）寄生于豬紅細(xì)胞表面，引起一種以溶血性貧血、黃疸和發(fā)熱為主要臨床癥狀的人畜共患傳染病[1]。M. suis 宿主范圍較廣，除豬外，人、犬、貓、牛等動(dòng)物均可感染，多呈隱性感染[2]。M. suis 寄生于宿主紅細(xì)胞表面使其變形和衰亡，導(dǎo)致機(jī)體貧血和免疫力下降，易引起其它病原體繼發(fā)感染，使病情加重和死亡率升高，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。截至目前，PE 無有效的治療藥物，一旦發(fā)病只能采取綜合治療方法延緩病程，幸存患病豬通常長(zhǎng)期攜帶病原體，并持續(xù)向外排毒，這是該病預(yù)防與病原體凈化的難題。因此，建立一種快捷、簡(jiǎn)便、特異和靈敏的早期檢測(cè)診斷方法顯得尤為重要。

目前，常用于PE 的檢測(cè)方法有吉姆薩染色、ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、PCR 和熒光定量PCR 等方法，但吉姆薩染色法存在著檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，ELISA 和IFA 不能用于早期診斷，以及PCR 和熒光定量PCR 需要昂貴專業(yè)儀器等缺點(diǎn)，而不能在基層推廣應(yīng)用，使PE 的早期臨床診斷受到影響[3-4]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isother?mal amplification method，LAMP）與其它分子檢測(cè)技術(shù)相比，不僅敏感性高，操作簡(jiǎn)便，而且不需要專業(yè)儀器，可用肉眼直接判讀結(jié)果，養(yǎng)殖戶可以自行操作檢測(cè)，便于基層養(yǎng)殖戶的實(shí)地推廣應(yīng)用。由于M. suis 的歸屬與定性較晚，以及全基因組剛被測(cè)通[5]，至今僅見李月梅等[6]以M. suis 的16S rRNA 為目的基因建立了LAMP 檢測(cè)方法，但由于所檢測(cè)基因?yàn)?6S rRNA，非病原體結(jié)構(gòu)基因，使該方法存在一定局限。因此，本研究擬以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因α-烯醇化酶（eno）基因?yàn)槟康幕?，在保守區(qū)設(shè)計(jì)4 條特異性引物，通過對(duì)反應(yīng)條件、反應(yīng)程序的優(yōu)化與篩選，建立一種快捷、簡(jiǎn)便、特異、敏感和易于推廣的LAMP 方法，為PE 的早期診斷和病原體凈化提供一種有效的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M. suis 及其陽性豬血液樣品均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。MgSO4（100 mmol/L）、EX Taq DNA 聚合酶、Bst DNA 聚合酶、10×ThemoPol Buffer、dNTP Mix（10 mmol/L）均購自NEB 公司；10 000×SYBR GreenⅠ染料購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.基因組提取試劑盒、E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)mega 公司；pMD18-T simple vector、DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司。84 份臨床疑似感染M. suis 的豬血液檢測(cè)樣品采自延邊州5 家豬養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 LAMP 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 中登錄的M.suis基因組（NC_015153），應(yīng)用Oligo6.0 軟件在eno 基因的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，P1：GGATCCAT GGCTTTTAGTATAGAAAATC/P2：CTCGAGTTCTGATA GACATCCAGCTTTA，分別含有BamH I 和Xho I 酶切位點(diǎn)，預(yù)期克隆目的片段大小為864 bp；應(yīng)用prim?er explorer V5 軟件，在上述eno 基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)4條特異引物，外引物為F3 和B3，即F3：GGGAA AATTCCTAAGTAAGAAGA/B3：AGAACTTGACAGATT CTTAATGG；內(nèi)引物為FIP 和BIP，即FIP：CAGCT AAGGTATTAGTTCCCTC/BIP：GGAGTTAAGAAAGCTG TTCACTACA。引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.3eno的擴(kuò)增與TA 克隆采用E.Z.N.A.基因組提取試劑盒提取本實(shí)驗(yàn)室保存的M. suis 基因組DNA 為模板，以P1/P2 為引物，進(jìn)行eno 基因擴(kuò)增，退火溫度為55 ℃，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后回收目的基因，進(jìn)一步進(jìn)行TA 克隆、酶切和測(cè)序，將酶切與測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD-eno。

1.4 LAMP 的反應(yīng)條件優(yōu)化與可視化檢測(cè)以測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD-eno 為模板，LAMP 檢測(cè)方法的基礎(chǔ)，反應(yīng)體系為：總體積為25 μL，質(zhì)粒F3/B3各取0.5 μL，F(xiàn)IP/BIP 各取4 μL，dNTPs（1.4 mmol/L）取3.5 μL，Mg2+1.5 μL（100 mmol/L），BstDNA Poly?merase 1 μL（320 U/mL），10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，模板2 μL，用ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：63 ℃，50 min，結(jié)束后80 ℃，2 min 終止反應(yīng)后進(jìn)行電泳觀察。

基于以上LAMP 反應(yīng)體系，利用方陣法進(jìn)行退火溫度（57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（30 min、40 min、50 min和60 min）、內(nèi)外引物濃度比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8 和1∶10）和鎂離子濃度（1 mmol/L、2mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L）的篩選，確定最優(yōu)的反應(yīng)條件。同時(shí)，以最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)，在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I 染料，觀察反應(yīng)體系是否發(fā)生有效顏色變化。

1.5 特異性試驗(yàn)利用E.Z.N.A.基因組提取試劑盒和E.Z.N.A. Bacteral DNA Kit 分別提取弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M.suis 的基因組作為模板，利用上述建立的LAMP 方法檢測(cè)，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立ddH2O 空白對(duì)照。

1.6 敏感性試驗(yàn)將重組質(zhì)粒pMO-eno 進(jìn)行10 倍倍比稀釋（100～107倍）后作為模板，即8 個(gè)梯度濃度（3×107拷貝/μL～3 拷貝/μL），同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，按照建立的LAMP 檢測(cè)方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。同時(shí)用1.3 中PCR 方法檢測(cè)，對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一時(shí)間提取M.suis基因組進(jìn)行10 倍倍比稀釋（10-1～10-6）后，應(yīng)用本研究已建立的LAMP 試驗(yàn)方法檢測(cè)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；取6個(gè)不同時(shí)間提取的M.suis基因組進(jìn)行10 倍倍比稀釋后，應(yīng)用本研究已建立的LAMP 試驗(yàn)方法檢測(cè)，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)。均設(shè)立ddH2O 陰性對(duì)照組。

1.8 臨床應(yīng)用試驗(yàn)應(yīng)用本研究建立的LAMP 方法和1.3 中PCR 方法，對(duì)延邊州84 份疑似感染M.suis的豬血液檢測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)2 份鏡檢和PCR 檢測(cè)M.suis 陽性樣品做陽性對(duì)照，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP 方法的建立以重組質(zhì)粒pMO-eno 為模板，利用方陣法優(yōu)化LAMP 檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)60 min，反應(yīng)溫度為63 ℃時(shí)，梯狀條帶最清晰（圖1A）。以63 ℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度進(jìn)行LAMP 試驗(yàn)反應(yīng)，結(jié)果顯示在設(shè)立的時(shí)間梯度中50 min 為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間（圖1B）。以63 ℃為反應(yīng)溫度，50 min 為反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行LAMP 試驗(yàn)，結(jié)果顯示在設(shè)立的鎂離子濃度6 個(gè)梯度中，6 mmol/L 為最佳反應(yīng)濃度（圖1C）。以M.suis基因組DNA 為目的基因，將外引物F3/B3 均設(shè)為0.2 μmol/L，設(shè)立外引物與內(nèi)引物濃度比梯度，進(jìn)行LAMP 試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)外內(nèi)引物濃度比為1∶6 時(shí)（圖1D），反應(yīng)梯度條帶最清楚，即為最佳引物濃度比。

圖1 LAMP 反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、Mg2+濃度（C）和引物濃度比（D）篩選結(jié)果Fig. 1 LAMP test results under different temperature(A), time(B), Mg2+ concentration(C), primer concentration ratio(D) screening

2.2 LAMP 可視化檢測(cè)在應(yīng)用建立的LAMP 試驗(yàn)反應(yīng)后，向試管里加入SYBR Green I 染料，在紫外燈下可見到陽性組呈現(xiàn)綠色熒光，而陰性組呈現(xiàn)橙色（圖2），表明本研究建立的LAMP 方法可以用肉眼直觀判讀結(jié)果。

2.3 特異性試驗(yàn)分別以雙蒸水，以及弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M. suis的基因組為模板，進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。結(jié)果顯示，僅M.suis出現(xiàn)熒光，ddH2O 空白對(duì)照和其它4 個(gè)病原體組均無熒光（圖3），即為陰性反應(yīng)，表明本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法具備良好的特異性。

圖2 LAMP 可視化結(jié)果Fig. 2 Visualization results of LAMP

圖3 LAMP 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Results of LAMP specificity test

2.4 敏感性試驗(yàn)將提取的重組質(zhì)粒pMO-eno 按照10 倍倍比稀釋成8 個(gè)梯度（100～107），按照本試驗(yàn)建立的LAMP 檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，其最低檢測(cè)稀釋倍數(shù)可達(dá)到106倍（30 拷貝/μL）（圖4），而普通PCR 檢測(cè)方法僅能檢測(cè)到104倍。以上結(jié)果表明，本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法具有較好的敏感性，比普通PCR 檢測(cè)方法敏感度高100 倍。

圖4 LAMP 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Results of LAMP sensitivity test

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)用已建立的LAMP 試驗(yàn)方法，進(jìn)行組內(nèi)與組間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，各反應(yīng)管均呈現(xiàn)綠色熒光，均為陽性。表明本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床應(yīng)用結(jié)果對(duì)84 份疑似感染M. suis 豬血液樣品、2份M.suis陽性豬血液樣品進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，2 份陽性樣品LAMP 檢測(cè)為陽性，而84份豬血液樣品中，LAMP 檢測(cè)出34份為陽性，陽性率為40%，其與平行PCR 檢測(cè)結(jié)果相符。表明本研究建立的LAMP檢測(cè)方法能夠進(jìn)行臨床應(yīng)用。

3 討 論

2007 年，陳金山等在對(duì)河南省的幾個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率為46.33%，死亡率達(dá)13.88%[7]。該病死亡率不高，但由于引起繼發(fā)感染，使感染豬死亡率升高，對(duì)仔豬的危害更為慘重。近期研究發(fā)現(xiàn)，Julia 等在德國(guó)南部的21 個(gè)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行PE 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M. suis 可以垂直傳播，初乳攝入前仔豬經(jīng)垂直傳播的感染率達(dá)14.35%[8]。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PE 流行的嚴(yán)重現(xiàn)狀，以及切斷垂直傳播的重要性。而且由于PE 是人獸共患傳染病，通過血吸蟲媒介傳播，對(duì)人類健康也造成了極為嚴(yán)重的安全隱患，這使預(yù)防PE 傳播與蔓延，切斷和凈化M. suis 成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

防控PE 的發(fā)生與傳播，早期發(fā)現(xiàn)和確診是關(guān)鍵。2010 年本研究組成員李月梅等以M. suis 的16S rRNA 為目的基因建立了LAMP 檢測(cè)方法，由于該方法選用16S rRNA 為目的基因，在提取與擴(kuò)增過程中受到其它相似病原體的影響較大，導(dǎo)致所建立的LAMP 方法存在一定局限性[6]。因此，以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因?yàn)槟康幕?，建立用于M. suis 診斷的LAMP檢測(cè)方法已是當(dāng)務(wù)之急。然而，一直以來關(guān)于M. suis 的研究較少，對(duì)于附紅細(xì)胞體的分類一直存在爭(zhēng)議，以至于一定時(shí)間內(nèi)對(duì)附紅細(xì)胞體是否真正存在仍質(zhì)疑，直至2011 年M. suis 的基因組被測(cè)通，最終證實(shí)了附紅細(xì)胞存在，并將其劃歸為支原體[9]，隨后相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和結(jié)構(gòu)蛋白被測(cè)通與證實(shí)，其中α-烯醇化酶基因（eno 基因）編碼的α-烯醇化酶，是M. suis 粘附宿主細(xì)胞的主要功能蛋白，在M. suis 入侵宿主和粘附細(xì)胞過程中起重要作用，并具有很好的免疫原性[10]，常用作血清學(xué)診斷的目的蛋白，而eno 基因由于其相對(duì)保守，常用作分子診斷的目的基因[9,11-13]。截止目前，未見有關(guān)于以M.suis 的結(jié)構(gòu)基因建立的LAMP 檢測(cè)方法的報(bào)導(dǎo)，本研究建立的M. suis 可視化LAMP 檢測(cè)方法，由于其以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因作為檢測(cè)基因，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可信。經(jīng)一系列試驗(yàn)驗(yàn)證，本研究建立的LAMP 方法具有特異、便捷、操作簡(jiǎn)單、不需要專業(yè)儀器和專業(yè)技術(shù)等特點(diǎn)，可用于基層養(yǎng)殖戶自己操作，便于隨時(shí)采樣、隨時(shí)診斷和隨時(shí)治療與防控。與常規(guī)PCR 方法相比，其所需時(shí)間縮短，特異性強(qiáng)，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，通過水浴鍋加熱即可實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增，不需要電泳，僅通過加入SYBR Green I染料即可通過紫外燈用肉眼判斷結(jié)果。其敏感度是普通PCR 的100 倍，檢測(cè)下限達(dá)30 拷貝/μL，與高旭等建立的M. suis TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法敏感性一致[2]。經(jīng)對(duì)84 份疑似感染M. suis 豬血液樣品、2份M.suis陽性樣品進(jìn)行LAMP 和PCR 檢測(cè)，證明本研究建立的LAMP 可用于臨床或?qū)嵉貦z測(cè)，可及時(shí)調(diào)查豬場(chǎng)中M. suis 感染情況，可以在感染的早期階段識(shí)別出攜帶病毒的仔豬，以便淘汰感染母豬，為控制疫情和凈化M. suis 將起到積極作用。

本研究建立的LAMP 方法是一種新型、廉價(jià)、靈敏、特異且快速的M.suis 檢測(cè)手段，臨床應(yīng)用與常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果相一致，LAMP 不需要嚴(yán)格的反應(yīng)條件、復(fù)雜的技術(shù)操作和專用設(shè)備，為養(yǎng)殖場(chǎng)M.suis 凈化提供了快速、便捷的分子診斷方法。