牛皰疹病毒1型gG/TK雙基因缺失株對豚鼠免疫保護(hù)效力的研究

楊 姣，王 琛，王安平，陳穎鈺，李慶妮，胡長敏，陳 曦*，郭愛珍,3,4,5*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部反芻動物生物制品重點實驗室，湖北 武漢 430070；4.湖北省動物疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070；5.動物生物藥物教育部工程研究中心，湖北 武漢 430070）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotrache?itis，IBR）是由IBR 病毒（IBRV）又稱牛皰疹病毒Ⅰ型（Bovine herpes virus type 1，BoHV-1）引起的一種急性、接觸性傳染病，又稱“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”[1]。BoHV-1 感染機(jī)體后，主要引起嚴(yán)重的呼吸道疾病、生殖道炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。此外，BoHV-1 可在三叉神經(jīng)節(jié)或扁桃體潛伏，使感染牛終生帶毒，各種應(yīng)激因素可激活潛伏的病毒，引起牛發(fā)病并排毒，使本病很難消滅和根除。我國不同地區(qū)牛群IBR的感染十分普遍，IBR血清抗體陽性率與養(yǎng)殖優(yōu)勢區(qū)的分布一致，牧區(qū)及半牧區(qū)牛群的IBR 血清抗體陽性率最高可達(dá)97.83%，是嚴(yán)重影響我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一[2]。

研制安全高效的疫苗是防控該病最有力的武器。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定，在對疫苗進(jìn)行效力評價時，需使用2～3 月齡IBR 血清抗體陰性犢牛作為實驗動物。然而，國內(nèi)目前的現(xiàn)狀很難選到抗體陰性的實驗牛[3]，因此建立實驗室小動物模型評價IBR 疫苗免疫效力是非常必要的。目前，豚鼠已成為多種疫苗的免疫效力評價模型，如口蹄疫疫苗[4]和結(jié)核疫苗等[5]。Parreno 等也將豚鼠用于IBR 滅活疫苗的效力評價研究，結(jié)果顯示豚鼠和牛體之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性和一致性，可以作為替代動物模型[6]，但缺失弱毒疫苗對豚鼠是否有效目前尚不清楚。

本實驗室前期構(gòu)建了BoHV-1 gG-/TK-株，牛體試驗已證實該疫苗株毒力顯著下降，能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，攻毒后可降低牛體排毒量和排毒時間，減輕臨床癥狀[7]。為探索豚鼠成為缺失弱毒疫苗效力評價模型的可行性，本研究進(jìn)行了Bo?HV-1 gG-/TK-株在豚鼠體內(nèi)的安全性和有效性研究。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和實驗動物BoHV-1 野生型毒株（wt BoHV-1，No.AJ004801）和BoHV-1 gG-/TK-株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室保存和構(gòu)建。牛腎（MDBK）細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。體質(zhì)量350 g～400 g SPF 級豚鼠（BoHV-1 特異性gB 抗體檢測為陰性）購自武漢科前生物股份有限公司。

1.2 主要試劑Prime STAR HS DNA Polymerase 購自TaKaRa 公司；BoHV-1 gB 抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；IFN-γ檢測試劑盒購自AVIVA公司。

1.3 病毒培養(yǎng)將保存的wt BoHV-1 和gG-/TK-缺失株分別接種于培養(yǎng)至單層的MDBK 細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后收毒，按常規(guī)方法[8]測定TCID50后用DMEM 培養(yǎng)基將病毒稀釋成不同工作濃度備用。

1.4 實驗設(shè)計16 只豚鼠隨機(jī)分4 組，每組4 只，間隔21 d 進(jìn)行兩次免疫接種，兩次接種途徑均為肌肉注射，首免后35 d，4 組豚鼠均經(jīng)鼻腔接種wt Bo?HV-1，具體方案見表1。

1.5 安全性檢測

1.5.1 體溫測定和臨床癥狀觀察 免疫前及免疫后1 d 測定豚鼠直腸溫度，以后每隔2 d 測定1 次豚鼠直腸溫度，分析溫度變化情況；同時，從免疫前開始觀察各組豚鼠臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、飲水采食、鼻腔分泌物和眼分泌物等。

表1 豚鼠試驗方案Table 1 The scheme of guinea pig experiment

1.5.2 病毒分離及鑒定 免疫前及首免后35 d 內(nèi)每隔7 d 采集各組豚鼠鼻拭子，按常規(guī)方法處理鼻拭子后接種于MDBK 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)5 d，觀察CPE，出現(xiàn)CPE 判定為陽性。5 d 后仍無CPE 則進(jìn)行盲傳，若盲傳3 代后仍無CPE，則判定為陰性。根據(jù)GenBank 中登錄的BoHV-1 的gG 基因核苷酸序列（No.AJ004801）設(shè)計引物（F：CCGACCGCCTCCTAC ACCAGATGCT/R： GGGTGTAGGCAAGCTCACCGCAA CG），采用該引物，以病毒核酸提取試劑盒提取的陽性樣本DNA 為模板，通過PCR 進(jìn)行病毒株鑒定。PCR 反應(yīng)體系為：模板2.0 μL，5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL；上下游引物各0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，補(bǔ)加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃1 min、60.5 ℃45 s、72 ℃2 min，35 循 環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。wt BoHV-1 預(yù)期擴(kuò)增gG 產(chǎn)物長度為1 859 bp，gG-/TK-缺失株預(yù)期擴(kuò)增gG 產(chǎn)物長度為524 bp。

1.6 特異性gB 抗體和中和抗體水平免疫前和首免后7 d、14 d、21 d、28 d 采集分離各組豚鼠血清，利用gB 抗體檢測試劑盒測定血清中g(shù)B 抗體，同時各血清56 ℃滅活30 min 后采用微量細(xì)胞中和試驗測定各組豚鼠各時間點血清BoHV-1 中和抗體效價。對比分析各組兩種抗體水平變化規(guī)律。

1.7 IFN-γ含量的測定免疫前和首免后3 d、5 d、7 d、14 d 集分離各組豚鼠血清，利用IFN-γ 試劑盒測定各組豚鼠各時間點血清IFN-γ 含量，對比分析各組血清IFN-γ 含量變化情況。

1.8 免疫保護(hù)評價首免后35 d，4 組豚鼠均以107TCID50/只經(jīng)鼻腔接種wt BoHV-1 株，每隔2 d 測量1 次直腸溫度，觀察記錄臨床癥狀。每日采集鼻拭子分離病毒，連續(xù)采集12 d，按照1.5.2 中方法進(jìn)行病毒分離檢測。攻毒后第12 d 無菌采集各組豚鼠肺，制作石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色，進(jìn)行肺組織病理學(xué)檢測。

1.9 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 軟件包中的相關(guān)程序（Student's t-test）分析，數(shù)值為平均值±SEM，p＜0.05 為差異顯著（*），p＜0.01（**）和p＜0.001（***）為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 安全性檢測在兩次免疫后，免疫組及對照組豚鼠均體溫正常，偶有一過性體溫升高，但平均溫度不超過39.1 ℃（圖1）。首免后第5 d，高劑量組1/4 豚鼠鼻腔有大量分泌物，1/4 豚鼠有少量分泌物，持續(xù)3 d；中劑量組2/4 豚鼠鼻腔出現(xiàn)少量分泌物，持續(xù)3 d。其余組豚鼠均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，飲水和采食均正常。表明該缺失株對豚鼠是安全的。

首免至攻毒前，各實驗組豚鼠鼻拭子洗脫液接種細(xì)胞后盲傳3 代，均未分離到病毒，豚鼠免疫該缺失株后并不向外排毒，進(jìn)一步表明其安全性良好。

2.2 血清gB 抗體檢測采集各組豚鼠血清，進(jìn)行g(shù)B 抗體檢測，結(jié)果顯示，免疫前各組豚鼠gB 抗體均為陰性，首免后7 d，3 個免疫組均產(chǎn)生gB 抗體（≥55%為陽性，45%～55%為可疑）。且首免后第7 d，14 d，21 d，28 d 和35 d，3 個免疫組gB 抗體均極顯著高于對照組（p＜0.001），其中首免后高劑量組gB 抗體持續(xù)高于其他各組，而在首免后28 d 時3個免疫組幾乎達(dá)到同一值，此后3 組共同處于平臺期（圖2）。表明與其他劑量組相比，高劑量BoHV-1-gG-/TK-缺失株可以快速誘導(dǎo)豚鼠機(jī)體gB 抗體水平達(dá)到峰值。

圖1 免疫后豚鼠平均體溫變化曲線Fig.1 Rectal temperature change of guinea pigs after immunization

圖2 免疫后豚鼠血清中的gB 抗體水平Fig. 2 gB antibody levels in guinea pigsera after immunization

2.3 血清中和抗體檢測采用微量細(xì)胞中和試驗法測定各組豚鼠各時間點血清中BoHV-1中和抗體效價，結(jié)果顯示，首免后14 d 各組血清可檢測到中和抗體，第21 d，高劑量組（1∶11.2）和中劑量組（1∶9.19）的中和抗體水平極顯著高于低劑量組（1∶2.17）（p＜0.01）。加強(qiáng)免疫后抗體水平急劇上升。第28 d，高劑量組（1∶308.00）與中劑量組（1∶193.50）之間，中劑量組與低劑量組（1∶20.80）之間，中和抗體水平差異極顯著（p＜0.01）。第35 d 時，高劑量組中和抗體水平稍有下降（1∶301.67），中劑量組（1∶216.95）極顯著高于低劑量組（1∶74.98）（p＜0.001）（圖3）。表明BoHV-1 gG-/TK-株能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生中和抗體，中和抗體水平與免疫劑量呈正相關(guān)。

2.4 血清中IFN-γ含量測定按IFN-γ 試劑盒測定各組豚鼠各時間點血清中IFN-γ 含量，結(jié)果顯示，一免后第5 d，血清中IFN-γ 含量達(dá)到峰值，3 個免疫組的IFN-γ 含量各時間點均極顯著高于對照組（p＜0.001），其中高劑量組IFN-γ 含量＞中劑量組＞低劑量組，但3 個免疫組之間差異不顯著（p＞0.05）（圖4）。表明該缺失株能在體內(nèi)快速誘導(dǎo)IFN-γ 反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。

圖3 各組豚鼠免疫后血清中和抗體水平Fig. 3 Neutralizing antibody (VN) titers in guinea pig sera after immunization

圖4 各組豚鼠血清中IFN-γ 動態(tài)變化Fig. 4 Dynamic changes of IFN-γ concentration in guinea pig sera after immunization

2.5 免疫保護(hù)評價

2.5.1 體溫變化和臨床癥狀 攻毒后，各組豚鼠均體溫正常。飲水和采食均正常，精神狀態(tài)良好。

攻毒后第2 d，低劑量組和中劑量組各有1/4 豚鼠鼻腔出現(xiàn)白色分泌物，均持續(xù)7 d。攻毒后第5 d，高劑量組2/4豚鼠鼻腔出現(xiàn)少量分泌物，持續(xù)1 d。對照組2/4 豚鼠鼻腔出現(xiàn)白色分泌物，持續(xù)1 d～11 d，1/4豚鼠出現(xiàn)深黃色或褐色鼻腔分泌物，持續(xù)1 d～6 d。

以上結(jié)果表明攻毒后對照組出現(xiàn)較重臨床癥狀，且持續(xù)時間最長；而免疫組的臨床癥狀均減輕，且時間較短，說明該缺失株發(fā)揮了保護(hù)作用。

2.5.2 鼻腔排毒檢測 攻毒后，3 個免疫組豚鼠采集的鼻拭子洗脫液均未分離到病毒，而對照組豚鼠分離到病毒，其從第1 d 或第2 d 開始排毒，平均持續(xù)時間為6 d～8 d（表2）。病毒PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（部分）電泳結(jié)果顯示，片段長度均為1 859 bp，判定病毒為wt BoHV-1，不是基因缺失株（圖5）。攻毒后只有對照組向外界排毒，而免疫組不排毒。進(jìn)一步表明BoHV-1 gG-/TK-株發(fā)揮了免疫保護(hù)作用。

2.5.3 攻毒后各組肺病理組織學(xué)變化 攻毒后采集各組豚鼠肺組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，結(jié)果可見各組豚鼠肺組織均表現(xiàn)出不同程度的病理損傷。低劑量組可見肺泡壁增厚、淤血和炎性細(xì)胞浸潤（圖6A）；中劑量組細(xì)胞病變較低劑量組稍輕（圖6B）；而高劑量組病變極其輕微（圖6C），與正常肺的結(jié)構(gòu)相似（圖6D）。對照組病變最嚴(yán)重，可見肺泡結(jié)構(gòu)消失、肺泡壁廣泛增厚、局部肺泡腔內(nèi)有壞死細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤和淤血（圖6E）。表明免疫高劑量BoHV-1 gG-/TK-株使豚鼠能抵抗強(qiáng)毒株攻擊，免疫效力最高，而低劑量和中劑量能產(chǎn)生部分保護(hù)效果。

表2 攻毒后豚鼠鼻腔排毒結(jié)果Table 2 Virals hedding of guinea pigs after challenge

圖5 PCR 檢測BoHV-1 病毒株類型Fig. 5 Detection of strain type of BoHV-1 by PCR

圖6 攻毒后各組豚鼠肺的病理組織學(xué)變化（蘇木素-伊紅染色）Fig. 6 Histopathological examination of guinea pig lungs after challenge (HE stain)

3 討 論

IBR 基因缺失疫苗可以選擇性的對IBRV 基因進(jìn)行缺失，缺失的基因可作為一種檢測標(biāo)志用于免疫和野毒感染動物的鑒別，是國際上IBR 根除計劃中兩大技術(shù)支撐之一。IBR gE 基因缺失疫苗和gG/TK雙基因缺失疫苗在歐盟上市后，被歐洲許多國家和美國廣泛應(yīng)用于IBR 的防控和根除。但我國目前尚無IBR 類似產(chǎn)品上市。

本研究將構(gòu)建的BoHV-1 gG-/TK-株進(jìn)行豚鼠體內(nèi)的安全性和有效性試驗。安全性結(jié)果表明，在豚鼠體內(nèi)BoHV-1 gG-/TK-株毒力明顯致弱，即使最高的免疫劑量達(dá)108TCID50/只，豚鼠仍未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，且不向外排毒，疫苗株是安全的。有效性試驗結(jié)果表明，雙基因缺失株能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答水平與免疫劑量呈正相關(guān)，這與其在牛體中引起的免疫反應(yīng)相似[7]，與Parreno 等報道的IBR 滅活疫苗在豚鼠體內(nèi)引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)也相似[6]，高劑量組誘導(dǎo)的中和抗體水平顯著高于其他兩組，該缺失株在免疫初期誘導(dǎo)豚鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ 產(chǎn)生，從而可以激活Th1 型細(xì)胞免疫反應(yīng)；gB 抗體是IBR 的特異性抗體，缺失株可以誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)，其可能參與病毒感染后的清除；攻毒后，3 個免疫組僅個別豚鼠出現(xiàn)輕微臨床癥狀，其中高劑量組癥狀最輕微，持續(xù)時間最短；3 個免疫組豚鼠鼻腔均不排毒，表明3 種免疫劑量均可有效抑制病毒增殖。豚鼠肺組織的病理變化顯示，高劑量組無明顯病理損傷，而低劑量組和中劑量組出現(xiàn)不同程度損傷，表明肺損傷程度與免疫劑量呈負(fù)相關(guān)，免疫劑量越大，病變程度越輕微。以上結(jié)果表明，免疫108TCID50/只的高劑量BoHV-1 gG-/TK-株能使機(jī)體完全抵抗強(qiáng)毒株攻擊，免疫保護(hù)效力最高，而低中劑量僅能產(chǎn)生部分保護(hù)效果。

van Drunen 等研究表明BoHV-1 gIV（gD）亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)黏膜免疫和體液免疫，中和抗體水平與攻毒后保護(hù)力之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性[9]。郭利等研究表明BoHV-1 LNM 株弱毒疫苗的保護(hù)效力與中和抗體水平之間存在一定的平行關(guān)系[10]。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，BoHV-1 gG-/TK-株在豚鼠體內(nèi)的保護(hù)效力與中和抗體水平之間存在一定平行關(guān)系，Bo?HV-1 gG-/TK-株免疫后，當(dāng)中和抗體效價高于1∶302時，可以對豚鼠產(chǎn)生良好的保護(hù)效力；1∶75＜抗體效價＜1∶217 時，產(chǎn)生部分保護(hù)效力。雖然以中和抗體為疫苗評價指標(biāo)非常簡單和客觀，但也不能一概而論，例如，能夠表達(dá)BoHV-1 gC 蛋白的人復(fù)制缺陷型腺病毒5 型重組毒株，其誘導(dǎo)的中和抗體水平雖然很低，但所有動物均獲得了保護(hù)力[11]，有研究報道中和抗體與保護(hù)力之間并無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性[12]。

本實驗并未同時開展牛體的免疫效力試驗，因此，目前對BoHV-1 gG-/TK-株在豚鼠和牛體的免疫效力的相關(guān)性尚不清楚，未來將開展相關(guān)工作。此外，盡管本研究確定低于108TCID50/只的接種劑量是安全的，但這并不是最低安全劑量，需要在107TCID50/只～108TCID50/只劑量之間再進(jìn)行后續(xù)試驗，才能確定機(jī)體獲得完全保護(hù)效力時的最小免疫劑量。

綜上所述，BoHV-1 gG-/TK-株在豚鼠體內(nèi)是安全的，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。本研究為建立IBR 疫苗的豚鼠評價模型奠定了基礎(chǔ)，同時也為IBR基因工程疫苗的研制提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。