基于重組P113 蛋白的山羊抗綿羊肺炎支原體抗體間接ELISA 檢測方法的建立及應(yīng)用

張煥容，張賢宇，楊發(fā)龍

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniaeniae，MO）可引起綿羊、山羊以及野生小反芻動(dòng)物的非典型肺炎[1-3]。羊感染MO 后，對多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌及副流感病毒等呼吸道病原的易感性明顯增強(qiáng)[2,4]，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。對MO 感染的準(zhǔn)確診斷和流行病學(xué)調(diào)查是其綜合防控的基礎(chǔ)。病原學(xué)與血清學(xué)檢測技術(shù)是動(dòng)物傳染病診斷的兩種重要技術(shù)。由于支原體培養(yǎng)較為困難，且在體外培養(yǎng)基中生長緩慢，傳統(tǒng)的病原分離鑒定方法無法用于MO 感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。因此，國內(nèi)外已先后建立了MO 的特異、敏感的PCR檢測方法[5-6]，是目前MO 感染病原學(xué)檢測的主要方法。

抗體檢測對疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評價(jià)至關(guān)重要，其中ELISA 以其靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作和批量檢測等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。但到目前為止，未見商品化的檢測MO 抗體的ELISA 試劑盒。國內(nèi)已有以MO 全菌抗原建立間接ELISA 抗體檢測方法的報(bào)道[7]。但由于MO 全菌抗原與其他相關(guān)支原體之間有明顯的交叉反應(yīng)[8]，為進(jìn)一步增強(qiáng)MO 抗體ELISA 檢測方法的特異性，近年來國內(nèi)多個(gè)學(xué)者先后采用重組P71[9]、P60（N）-P65（C）[10]以及P130[11]等MO 抗原蛋白建立了間接ELISA 抗體檢測方法。

黏附素是支原體的膜表面蛋白和毒力因子，同時(shí)也是優(yōu)勢免疫原，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的保護(hù)性抗體，是建立支原體血清學(xué)檢測技術(shù)的最佳抗原之一。因此，針對其他多種支原體，已建立了基于重組粘附素的ELISA 抗體檢測方法[12-15]。在MO中，P113 蛋白是預(yù)測的黏附素之一[16]，并已證明P113 蛋白是良好的免疫原[17-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)以P113 重組蛋白（rP113）作為包被抗原，建立MO 抗體的間接ELSIA 檢測方法（rP113-ELISA），為MO ELI?SA 診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，從而最終為MO 感染的綜合防治提供有力的工具，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料MO SC01 株和Y98 株由本實(shí)驗(yàn)室保存；18 份間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測MO 陽性和24 份陰性山羊血清由本實(shí)驗(yàn)室收集、驗(yàn)證和保存；山羊抗MO SC01 株和Y98 株、山羊支原體山羊亞種（Mcc）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）、絲狀支原體絲狀亞種LC 型（MmmLC）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）陽性血清以及布魯氏菌S2 株山羊高免血清、羊口瘡病毒（OFRV）陽性血清以及MO 疫苗免疫羊血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；80 份山羊臨床血清樣品采自四川省雙流縣、南江縣、攀枝花市等地的羊場。

脫脂奶粉購自BD 公司；BSA 購自Blotopped 公司；HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG（IgG-HRP）購自EARTHOX公司；1-StepTMUltra TMB-ELISA 試劑購自Thermo 公司；Tween-20 購自Sigma 公司；血清樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體稀釋液購自武漢博士德公司；酶標(biāo)板購自COSTAR 公司。原核表達(dá)載體pET-32a（+）購自Nova?gen 公司；T4 DNA 連接酶、DH5α 和Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；Plasmid Miniprep Kit 購自AXYGEN 公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自NEB 公司；HistrapTMHP 純化柱購自GE 公司。MO 抗體IHA 檢測試劑購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 rP113 的制備按照文獻(xiàn)[17]方法制備MO rP113，用作包被抗原。簡要過程為：以MO SC01 株基因組DNA 為模板，采用引物P113（c）F：5'-CGCG GATCCGAAGGTGCTCAAGACCAAGGTA-3'/P113（c）R：5'-CCGCTCGAGGGTTGTTGTTGAGGTGGTATCAGG-3'擴(kuò)增編碼P113 蛋白C 端重復(fù)序列的DNA 片段，并純化目的片段。利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ分別對純化的目的片段和pET-32a（+）載體雙酶切后，回收純化，經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。篩選獲得陽性克隆后采用Axy?PrepTMPlasmid Miniprep Kit 提取重組質(zhì)粒。經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）中，37 ℃經(jīng)0.4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)6 h 后，利用HistrapTMHP 純化柱純化目的蛋白，獲得rP113，并經(jīng)SDS-PAGE 檢測。采用改良型BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.3 間接ELISA 方法的建立采用方陣試驗(yàn)確定抗原最佳包被量（0.05 μg/孔、0.1 μg/孔、0.2 μg/孔和0.4 μg/孔）、陰、陽性血清稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）、封閉液及其濃度（5%和10%脫脂奶粉、1%和2%BSA、5%馬血清和1%明膠）、兔抗山羊IgG（酶標(biāo)二抗）稀釋度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000和1∶8 000）、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間（30 min、60 min 和90 min）、加入酶標(biāo)二抗后反應(yīng)時(shí)間（30 min、60 min和90 min），反應(yīng)溫度均為37 ℃，底物顯色時(shí)間10 min，經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD450nm值，選擇陰性O(shè)D450nm平均值最小，且P/N 值最大的孔對應(yīng)的反應(yīng)條件為最佳條件。

1.4 間接ELISA 陰陽性臨界值的確定采用優(yōu)化的間接ELISA 方法測定24 份MO 抗體陰性山羊血清，每份重復(fù)2 孔，讀取并計(jì)算每份樣品的平均OD450nm。計(jì)算平均值（-X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），并根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450nm≥-X+3S 判定為陽性，OD450nm≤-X+2S 判定為陰性，介于二者之前的為可疑[7]。

1.5 特異性試驗(yàn)利用建立的間接ELISA 方法，對山羊抗MO Y98 株、MO SC01 株、Mcc、Mccp、Mm?mLC、Mmc 陽性血清，以及布魯氏菌S2 株山羊高免血清、OFRV 陽性血清及1 份陰性山羊血清進(jìn)行檢測，以評估建立的間接ELISA 方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)將IHA 效價(jià)為1∶210的MO SC01 株陽 性 血 清2 倍 倍 比 稀 釋（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400），以MO Y98 株陽性血清作為陽性對照，利用本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測，計(jì)算能夠檢出陽性血清的最高稀釋度。同時(shí)，為了進(jìn)一步評價(jià)該方法的敏感性，用該方法對IHA 檢測為陽性的18 份血清樣品進(jìn)行檢測。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)隨機(jī)取5 份血清，用同一批次的酶標(biāo)板，在同一條件下進(jìn)行檢測，每個(gè)血清樣品做5 個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)，評價(jià)該方法的批內(nèi)重復(fù)性。對上述5 份血清用5 個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測，每個(gè)血清樣品做5 個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)，評價(jià)批間重復(fù)性。

1.8 MO滅活疫苗免疫山羊后山羊抗體的檢測采用文獻(xiàn)[19]中的方法，制備MO 滅活苗，滅活疫苗免疫M(jìn)O抗原及抗體雙陰性的山羊3只，不同時(shí)間采血分離羊血清。利用建立的rP113-ELISA 和商品化的MO IHA，檢測上述山羊血清中MO抗體OD450nm值，測定抗體消長規(guī)律，并比較兩種方法的符合率。

1.9 臨床血清樣品檢測利用建立的rP113-ELISA和IHA 方法，對80 份采自不同地點(diǎn)的山羊臨床血清樣品進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果，分析兩種方法對臨床樣品檢測的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的制備純化的rP113 經(jīng)SDS-PAGE分析顯示無雜帶。經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒定量，rP113 濃度為816 μg/mL。

2.2 間接ELISA 條件的優(yōu)化結(jié)果采用抗原、抗體方陣滴定法確定了rP113 抗原的包被量和血清稀釋度，并在該基礎(chǔ)上對間接ELISA 各條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表1 所示。

表1 rP113-ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized reaction conditions of rP113-ELISA

2.3 間接ELISA 臨界值的確定采用已優(yōu)化好的間接ELISA方法對24份陰性血清進(jìn)行兩次重復(fù)檢測，將獲得的OD450nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算結(jié)果為，-X=0.178，S=0.049，即-X+3S=0.324，-X+2S=0.275。因此，當(dāng)樣品OD450nm≥0.324 時(shí)為陽性；樣品OD450nm＜0.275 時(shí)為陰性，0.275＜OD450nm≤0.324 時(shí)為可疑。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的rP113-ELISA 對山羊抗不同病原的陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，除MO SC01 株和Y98 株陽性血清出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)外，其余病原血清反應(yīng)結(jié)果均為陰性（表2）。表明所建立的rP113-ELISA 特異性較強(qiáng)。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of the specificity test

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的間接ELISA 檢測方法對不同稀釋度的MO 陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示當(dāng)陽性血清稀釋到1∶3 200 時(shí)，OD450nm值仍然高于臨界值0.324（表3）。同時(shí)，對18 份IHA 檢測陽性的血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性，表明建立的間接ELISA 敏感性較高。

表3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of the sensitivity test

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果對隨機(jī)選取的5 份臨床血清樣品，采用同一批次包被的ELISA 板檢測，每份樣品重復(fù)檢測5 孔，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為0.60%～4.23%。對上述5 份臨床血清樣品，采用5 批次的ELISA 板檢測，每份樣品重復(fù)檢測5 孔，結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)為0.44%～2.38%（表4）。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 兩種方法對免疫山羊抗體消長的測定結(jié)果利用本研究建立的rP113-ELISA 和購自蘭州獸醫(yī)研究所的IHA 試劑盒，對MO 滅活疫苗免疫前的3 只山羊（A、B、C）血清，及免疫后（1 周、2 周、3 周、4 周及8 周）的血清，檢測其抗體水平。rP113-ELISA 檢測結(jié)果顯示，免疫前（0 周），所有山羊血清抗體均為陰性，免疫1 周后抗體迅速升高，3 周后抗體水平達(dá)到最高，4 周至8 周開始下降，檢測所得抗體消長曲線符合體液免疫應(yīng)答的基本規(guī)律（圖1），表明采用所建立的間接ELISA 方法檢測的結(jié)果能反映出疫苗免疫后山羊血清抗體的變化趨勢。 rP113-ELISA 的檢測結(jié)果與IHA 檢測結(jié)果所反映出的疫苗免疫山羊抗體消長規(guī)律一致，但rP113-ELISA 檢測結(jié)果更能靈敏地反應(yīng)抗體的變化。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 The reproducibility test of the rP113-ELISA (n=5)

圖1 rP113-ELISA 及IHA 對滅活疫苗免疫山羊抗體消長的檢測Fig. 1 Detection of antibodies induced by inactivated M. ovipneu?moniae vaccine in immunized goats using rP113-ELISA and IHA

2.8 臨床樣品的檢測結(jié)果采用建立的rP113-ELI?SA 和MO 抗體IHA 試劑盒對采集自四川省南江縣、雙流縣和攀枝花市的共80份山羊血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，rP113-ELISA 檢測的陽性率為38.78%（31/80），IHA試劑盒檢測的陽性率為30%（24/80）。其中，21份血清用兩種方法檢測均為陽性，有10 份血清rP113-ELISA 檢測為陽性，但I(xiàn)HA 檢測為陰性，兩種方法的陽性符合率為87.5%（21/24）；46份血清兩種方法檢測均為陰性，其中有3 份血清IHA 檢測為陽性，但rP113-ELISA 檢測為陰性，兩種方法的陰性符合率為82.1%（46/56）。表明rP113-ELISA比IHA更靈敏。

3 討 論

采用血清學(xué)技術(shù)檢測MO 抗體是對其感染進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、檢測和疫苗免疫效果評價(jià)的重要手段。良好的血清學(xué)方法需要特異、敏感且穩(wěn)定可靠。采用完整病原體作為包被抗原時(shí)，由于抗原成份復(fù)雜，很難避免與其他病原特別是親緣關(guān)系近的病原的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，從而難以保證檢測方法的特異性。因此，本研究通過對MO 特異性粘附素蛋白P113 進(jìn)行原核表達(dá)，制備rP113 作為包被抗原，建立了檢測MO 特異性抗體的間接ELISA 方法（rP113-ELISA）。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，rP113-ELI?SA 僅對山羊抗MO Y98 株和SC01 株陽性血清檢測結(jié)果為陽性，而對綿羊及山羊易感染的其他支原體，如Mcc、Mccp、MmmLC、和Mmc 等病原的陽性血清，以及對山羊抗布魯氏菌和ORFV 的陽性血清檢測均為陰性，表明所建立的方法具有較強(qiáng)的特異性，適合對山羊抗MO 的特異性抗體的檢測。

敏感性是評價(jià)血清學(xué)檢測技術(shù)的另一重要指標(biāo)。因此，用于建立血清學(xué)方法的抗原，不僅要具有高度特異性，同時(shí)應(yīng)該是病原的優(yōu)勢免疫原，即病原感染后該抗原成分可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體。黏附素是支原體重要的毒力因子和優(yōu)勢免疫原，在感染機(jī)體后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答，因此也成為各種支原體血清學(xué)診斷技術(shù)建立時(shí)最主要的候選抗原。例如，采用人肺炎支原體黏附素P30 重組蛋白建立的間接ELISA[12]以及采用豬肺炎支原體黏附素P97 重組蛋白建立的間接ELI?SA[13]，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性。因此，本研究選擇了MO 的黏附素P113 蛋白作為抗原，本研究室在前期的研究已證明該蛋白同樣是良好的免疫原[17]，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，說明其具有作為診斷抗原的潛在價(jià)值。本研究對IHA 檢測為陽性的18 份血清用建立的間接ELISA 方法檢測，結(jié)果也均為陽性，說明其對已知陽性血清的檢測敏感性為100%。此外，與IHA 方法相比，rP113-ELISA對臨床樣品的檢測陽性率更高，在驗(yàn)證了其特異性的前提下，還進(jìn)一步證明了rP113-ELISA 比IHA 具有更高的敏感性。

為進(jìn)一步檢測所建立的rP113-ELISA 方法在臨床上的應(yīng)用效果，本研究分別對疫苗免疫山羊和臨床采集的山羊血清中的MO 抗體進(jìn)行了檢測，并與IHA 方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，所建立的rP113-ELISA 方法與IHA 方法檢測結(jié)果所反映出的疫苗免疫后抗體的消長規(guī)律一致。同時(shí)，對80 份臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，rP113-ELISA 和IHA 的檢測結(jié)果陽性符合率為87.5%，陰性符合率為82.1%，rP113-ELISA 檢測的陽性率高于IHA。雖然兩種方法對免疫抗體和臨床樣品檢測的結(jié)果存在一定的差異，但綜合兩方面的臨床應(yīng)用結(jié)果判斷，rP113-ELISA 檢測的陽性率更高，說明其具有更高的檢測敏感度。兩種方法對80 份臨床樣品檢測時(shí)，有3 份IHA 檢測為陽性的樣品經(jīng)rP113-ELISA 檢測為陰性，分析出現(xiàn)該結(jié)果的原因不排除是由于IHA 采用全菌抗原而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。此外，由于IHA 方法在結(jié)果判定上更易受到人為因素的影響，另一方面，與ELI?SA 方法不同，IHA 是對血清倍比稀釋后進(jìn)行檢測和判定，結(jié)果數(shù)值是非連續(xù)的，不能反映不同濃度抗體間的細(xì)微差異，因此rP113-ELISA 比IHA 更敏感。

本研究建立了一種基于MO 黏附素rP113 蛋白的間接ELISA 抗體檢測方法rP113-ELISA，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測重復(fù)性好的特點(diǎn)，為MO 感染的診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫抗體的監(jiān)測等提供了可靠的技術(shù)手段。