桃金娘鞣質(zhì)抗豬流行性腹瀉病毒作用研究

劉 偉，銀慧慧，何 穎，趙 武，馮林川，孟 菲，施 文，姜源明，覃振華，孫建華

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001； 2.廣西康普動(dòng)物保健品股份有限公司，南寧 530001； 3. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

鞣質(zhì)是廣泛分布于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物[1]，具有抑菌、抗氧化、抗病毒等多方面的藥理活性[2]。鞣質(zhì)含有多個(gè)酚羥基具有較強(qiáng)極性，遇金屬離子生成縮合物而不易提出，遇酸堿不穩(wěn)定，溫度過高發(fā)生分解或變性，多數(shù)水溶性多酚類化合物能溶于水，但同時(shí)發(fā)生水解[2-3]。因此，從植物中提取分離完整的鞣質(zhì)成分并保存其生物活性，對(duì)工藝條件有較高的要求。課題組在前期研究中曾利用超臨界CO2萃取技術(shù)在低溫、非水溶劑狀態(tài)下從桃金娘[Rhodomyrtustomentosa(Ait)Hassk., Myrtle]根莖中分離得到一種鞣質(zhì)[4]。當(dāng)前，對(duì)桃金娘鞣質(zhì)抗病毒作用的研究還比較少，因此本研究進(jìn)行了桃金娘鞣質(zhì)抗豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhae Virus，PEDV)試驗(yàn)，以期為開發(fā)桃金娘新獸藥提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 桃金娘鞣質(zhì)，由廣西獸醫(yī)研究所獸藥新技術(shù)開發(fā)中心從野生桃金娘根莖中分離，制成50 mg/mL無菌溶液；利巴韋林注射液，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993415，產(chǎn)品批號(hào): 1804292611。

1.1.2 病毒和細(xì)胞株 豬流行性腹瀉病毒分離株(PEDV-CH/GX/2015/750A)，由廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室分離鑒定、保存；PK細(xì)胞株，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑與設(shè)備 胎牛血清、MTT購(gòu)自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨公司；其他試劑均為分析純；Lightcycler2.0熒光定量PCR儀，Roche公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PEDV細(xì)胞毒力測(cè)定 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整濃度為1×105/mL，按100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，依次接種經(jīng)10倍連續(xù)稀釋的病毒液100 μL/孔，每濃度重復(fù)8孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照；37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)，并按MTT法酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處吸光度A490，根據(jù) Reed-Muench公式計(jì)算PEDV半數(shù)感染濃度(TCID50)。

細(xì)胞存活率=各組A490值/正常細(xì)胞A490值×100%

比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病變率)×100%

TCID50=Antilog(高于50%病變的病毒最高稀釋度對(duì)數(shù)+比距×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù))

1.2.2 桃金娘鞣質(zhì)細(xì)胞毒力測(cè)定 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整濃度為1×105/mL，按100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，桃金娘鞣質(zhì)用細(xì)胞維持液按2倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，按100 μL/孔依次接種，每濃度重復(fù)8孔，設(shè)空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照；37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)，按MTT法，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處吸光度A490，根據(jù) Reed-Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)，依靠濃度梯度試驗(yàn)直接測(cè)定最大無毒濃度(TC0)。

TC50=(Antilog高于50%CPE百分率病毒稀釋度對(duì)數(shù)+比距)×初始濃度

1.2.3 桃金娘鞣質(zhì)體外抗PEDV測(cè)定 將1×105/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液；試驗(yàn)藥物組將桃金娘鞣質(zhì)從最大無毒濃度按10倍比稀釋5個(gè)滴度濃度，50 μL/孔依次加入96孔板中，隨后加入100 TCID50的病毒液50 μL/孔，混合均勻，每濃度重復(fù)8孔；同步設(shè)利巴韋林藥物對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)，按MTT法，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處吸光度A490，根據(jù) Reed-Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)及治療指數(shù)(TI)。

EC50=Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)×初始濃度

TI=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

1.2.4 桃金娘鞣質(zhì)體內(nèi)抗PEDV試驗(yàn) 60只昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)均分為6組。第1組為藥物低劑量組，給予桃金娘鞣質(zhì)25 mg/kg；第2組為藥物中劑量組，給予桃金娘鞣質(zhì)50 mg/kg；第3組為藥物高劑量組，給予桃金娘鞣質(zhì)100 mg/kg；第4組為陽性藥物組，給予利巴韋林25 mg/kg；灌胃給藥，灌服容積為1 mL/只，給藥0.5 h后各組均以100 TCID50劑量PEDV灌胃攻毒；第5第6組分別為病毒對(duì)照組和陰性對(duì)照組。攻毒后第48 h，處死試驗(yàn)小鼠，摘取并稱量腸系膜淋巴結(jié)，置于研磨器中加入無菌生理鹽水或PBS緩沖液研磨，勻漿后轉(zhuǎn)至滅菌離心管中，反復(fù)凍融3次，8000 r/min離心2 min，取上清-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照北京世紀(jì)元亨公司柱式RNA核酸提取試劑盒使用說明書進(jìn)行PEDV RNA提?。话凑帐兰o(jì)元亨豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行PEDV的擴(kuò)增，主要反應(yīng)條件為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；循環(huán)95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40次；在每次循環(huán)第二步(60 ℃ 35 s)收集熒光信號(hào)；每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。按照F=2-△△Ct公式計(jì)算相對(duì)病毒載量。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃金娘鞣質(zhì)體外抗病毒作用 經(jīng)測(cè)試，PEDV對(duì)PK細(xì)胞的TCID50為10-4.1。由表1可知，桃金娘鞣質(zhì)與對(duì)照藥物利巴韋林對(duì)PK細(xì)胞體系中的PEDV都具有一定的抑制作用，桃金娘鞣質(zhì)EC50高于利巴韋林(P<0.05)，表明桃金娘鞣質(zhì)抑制病毒需要更高的藥物濃度；桃金娘鞣質(zhì)對(duì)PEDV的TI值顯著優(yōu)于利巴韋林(P<0.05)，表明桃金娘鞣質(zhì)及其成分具有較大抗病毒研究?jī)r(jià)值。

2.2 桃金娘鞣質(zhì)體內(nèi)抗病毒作用 由圖1可知，桃金娘鞣質(zhì)高、中、低劑量組和對(duì)照藥物利巴韋林組小鼠腸系膜淋巴結(jié)PEDV含量均顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.05)，顯示體內(nèi)抑制PEDV增殖作用；桃金娘鞣質(zhì)高、中劑量組體內(nèi)抑制病毒效果明顯優(yōu)于對(duì)照藥物利巴韋林組(P<0.05)；桃金娘鞣質(zhì)高劑量、中劑量、低劑量組間對(duì)PEDV的抑制作用具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

表1 桃金娘鞣質(zhì)體外抗PEDV作用Tab 1 Effects of myrtle tannins anti-PEDV in vitro

標(biāo)注不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) different letters indicate that there are significant differences between groups(P<0.05)圖1 桃金娘鞣質(zhì)對(duì)小鼠腸系膜淋巴結(jié)PEDV含量的影響Fig 1 Effects of myrtle tannins on PEDV content in mesenteric lymph nodes of mice

3 討論與結(jié)論

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬病毒，引起以嘔吐、腹瀉、脫水為主要臨床特征的豬流行性腹瀉(PED)。PED尤其危害仔豬，年齡越小越易感，癥狀越重，死亡率越高，臨床上缺乏防治特效藥物，PED每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[5]。研究中草藥抗PEDV藥理活性，從傳統(tǒng)中草藥中發(fā)掘抗PEDV化學(xué)成分或組方，是研發(fā)PED臨床防治藥物的重要途徑。桃金娘是中國(guó)南方地區(qū)特別是壯族地區(qū)傳統(tǒng)中草藥，民間廣泛用于治療急/慢性腸胃炎、消化不良、痢疾、腹瀉、嘔吐、肝炎、出血等疾病[6]。桃金娘富含鞣質(zhì)類成分，鞣質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酚類化合物，具有廣泛的生物活性[7]。研究表明，桃金娘總多酚具有抗氧化活性和自由基清除活性[8]，還具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性[9]，從桃金娘鞣質(zhì)中檢測(cè)到?jīng)]食子酸、鞣花酸、白皮杉醇和白藜蘆醇4種酚類物質(zhì)[10]；鞣花酸能增強(qiáng)拉米夫定(3TC)抗乙型肝炎病毒(HBV)作用[11]。

本試驗(yàn)考察了桃金娘鞣質(zhì)在體外PK細(xì)胞體系和小鼠體內(nèi)抗PEDV的效果。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，桃金娘鞣質(zhì)達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)正常PK細(xì)胞具有一定的毒性作用，半數(shù)中毒濃度TC50為7.6 mg/mL，最大無毒濃度TC0為2.3 mg/mL；桃金娘鞣質(zhì)對(duì)PK細(xì)胞體系中的PEDV具有明顯抑制作用，半數(shù)有效濃度EC50為0.021 mg/mL，對(duì)PEDV的治療指數(shù)TI為361.9，高于抗病毒藥物利巴韋林TI值214.28。治療指數(shù)TI值是藥物的安全性指標(biāo)，可以用來衡量藥物的潛在研究?jī)r(jià)值，TI值越大藥物的研究?jī)r(jià)值越大，TI>2表示藥物作用明顯，TI>4表示藥物具有開發(fā)價(jià)值。從桃金娘鞣質(zhì)對(duì)PEDV的TI值分析，桃金娘鞣質(zhì)可能具有很好的抗病毒藥物開發(fā)價(jià)值；并推測(cè)桃金娘鞣質(zhì)對(duì)PED的治療作用優(yōu)于利巴韋林。體內(nèi)試驗(yàn)采用PEDV感染小鼠，通過檢測(cè)病毒含量來考察桃金娘鞣質(zhì)體內(nèi)抗病毒作用，結(jié)果表明，與病毒對(duì)照組相比，桃金娘鞣質(zhì)顯著降低腸系膜淋巴結(jié)PEDV含量，據(jù)此推測(cè)桃金娘鞣質(zhì)具有體內(nèi)抑制PEDV增殖作用。桃金娘鞣質(zhì)在體外、體內(nèi)均具有一定抗PEDV藥理活性，但具體是哪一種或幾種化學(xué)成分具有抗病毒作用，抗病毒作用機(jī)制如何，以及對(duì)PED臨床治療效果如何，均有待進(jìn)一步研究。

桃金娘鞣質(zhì)能明顯抑制PEDV引起的細(xì)胞病變，半數(shù)有效濃度為0.021 mg/mL，治療指數(shù)為361.9；能有效降低PEDV感染小鼠體內(nèi)病毒數(shù)量；桃金娘鞣質(zhì)具有體外、體內(nèi)抗PEDV藥理活性，具有進(jìn)一步開發(fā)抗病毒藥物的價(jià)值。