六種傳代細胞系的致瘤性研究

王磊，楊承槐，王團結，劉瑩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

原代細胞用于生物制品的生產已有50多年的歷史，但是其存在傳代次數(shù)有限、組織來源很難保證均一穩(wěn)定、生產成本較高等諸多制約因素。傳代細胞系作為理想的替代用生產基質可以很好地克服以上缺點。為確保生物制品的安全性，在進行生物制品研發(fā)生產前，應對作為生產用的傳代細胞系進行致瘤性檢驗[1-3]。用于研發(fā)和生產的傳代細胞系致瘤性與否會直接關系到相關生物制品的種類、生產用細胞最高代次的限定以及相關質量標準的制定等諸多方面[4-5]。目前WHO和我國藥典對于細胞致瘤性檢驗推薦的方法主要是動物體內接種法[1-3]。體內法具有檢驗敏感性好、判定結果直觀、結果重復性好等諸多優(yōu)點，是針對細胞致瘤性檢驗的“金標準”。

中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(國家獸醫(yī)微生物資源平臺)保藏的羊睪丸細胞系(OA3.Ts)、牛腎細胞系(MDBK)、小鼠成纖維細胞系(McCoy)、豬睪丸細胞系(ST)、豬腎細胞系(PK-15)、猴腎細胞系(Marc-145)均是獸用生物制品研發(fā)生產中的常見傳代細胞系。其中OA3.Ts、MDBK對羊痘病毒、羊口瘡病毒、牛病毒性腹瀉病毒等牛羊病病毒易感，可作為草食動物疫病疫苗研發(fā)生產用細胞[6-7]； McCoy是針對導致豬回腸炎的勞森菌的最佳體外宿主，可用于豬回腸炎疫苗的研發(fā)生產； ST、PK-15和Marc-145均對多種病毒易感并已用于疫苗生產[8]。

鑒于目前對上述非禽源細胞系的致瘤性研究報道較少，本研究采用動物體內接種法對上述6種常見生產用傳代細胞系的基礎代次進行致瘤性研究，為生產用傳代細胞系的安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細胞 BHK-21細胞第55代、Marc-145細胞第18代、McCoy細胞(原始代次不明)第18代、ST細胞第125代、OA3.Ts細胞第29代、MDBK 細胞第9代、PK-15 細胞第135代，上述使用的細胞均為基礎種子庫細胞，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏。雞胚成纖維細胞(CEF)為中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心細胞實驗室使用SPF雞胚自行分離的原代細胞。

1.1.2 實驗動物 Nu-Nu品系裸鼠，雌性，6～8周齡，共80只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所大興生物實驗基地。飼養(yǎng)期間各組裸鼠飲用水均為高壓滅菌純凈水，飼料及墊料均為輻照滅菌產品，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎保障處提供。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25 ℃。所有操作均符合中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實驗倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將80只裸鼠隨機分為8組，處理組分為MDBK細胞組、OA3.Ts細胞組、Marc-145細胞組、McCoy細胞組、PK-15細胞組、ST細胞組，每種細胞培養(yǎng)物注射10只裸鼠。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組各注射10只裸鼠。

1.2.2 細胞培養(yǎng)物收集與接種 每種細胞培養(yǎng)10個175 cm2培養(yǎng)瓶的細胞量。按《中國獸藥典》方法消化、收集每種細胞系的細胞培養(yǎng)物懸液進行細胞計數(shù)后，1000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，用無血清DMEM重懸。每只裸鼠頸背部消毒后，于皮下注射約0.3 mL細胞培養(yǎng)物。處理組每只裸鼠注射107以上個細胞。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組注射106以上個細胞(表1)。

表1動物分組Tab 1 Experimental animal grouping

1.2.3 接種后觀察與剖檢 接種后的裸鼠連續(xù)觀察35日，檢查有無結節(jié)或腫瘤形成。如有結節(jié)或可疑病灶需進行剖檢。對未發(fā)生結節(jié)的動物，取一半數(shù)量進行剖檢。對另一半未發(fā)生結節(jié)的動物繼續(xù)觀察至12周，對接種部位進行剖檢，觀察有無結節(jié)形成。BHK-21細胞陽性對照組和雞胚成纖維細胞陰性對照組35日后全部進行剖檢。

1.2.4 組織切片取材、制備及病理學檢查 斷頸處死裸鼠，所有處理組和對照組裸鼠剖檢后均需進行組織病理學檢查。取注射部位附近皮膚組織、肝臟組織、腎臟組織、脾臟組織，如處理組和陽性對照組剖檢發(fā)現(xiàn)結節(jié)或可疑病灶，則取出裸鼠皮下結節(jié)及可疑病灶，均放入4%多聚甲醛固定24～48 h。將固定后的樣品制備石蠟包埋切片后，經(jīng)H-E染色后鏡檢。

2 結果與分析

2.1 陽性、陰性對照組結果 經(jīng)觀察35日后，BHK-21細胞陽性對照組的裸鼠頸背部接種部位均發(fā)現(xiàn)有明顯腫塊(表2)，且結節(jié)直徑4～10 mm左右，精神萎頓、采食量下降；經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，全部小鼠的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均無明顯結節(jié)(圖1A)。對小鼠腫塊、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測發(fā)現(xiàn)：結節(jié)組織腫瘤細胞體積偏大，細胞核與細胞質的比例增大，細胞核形態(tài)大小不一，染色質粗糙，出現(xiàn)病理性核分裂象，肝臟、腎臟、脾臟組織未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞(圖2A)。此外，陽性對照組中一只裸鼠在肺臟部位發(fā)現(xiàn)有病理性核分裂象的存在，疑似發(fā)生了腫瘤細胞肺部轉移的現(xiàn)象(圖2B)。由圖1B可知，注射CEF細胞的陰性對照組小鼠未見結節(jié)或可疑腫瘤組織，精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。取10只裸鼠進行剖檢并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟進行組織切片檢測，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。

表2 各組裸鼠成瘤數(shù)量統(tǒng)計Tab 2 Experimental animal grouping

2.2 實驗處理組結果 實驗處理組，注射ST、MDBK、OA3.Ts細胞的3組裸鼠，觀察35日精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，均未見結節(jié)或可疑腫瘤組織(圖1C、圖1G、圖1H)。各組取各5只裸鼠進行剖檢，并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。繼續(xù)飼養(yǎng)觀察

箭頭所指位置為結節(jié)或可疑病灶 A：BHK-21細胞陽性對照組；B：CEF細胞陰性對照組；C：ST細胞處理組 D：PK-15細胞處理組； E：McCoy細胞處理組；F：Marc-145細胞處理組；G：MDBK細胞處理組；H：OA3.Ts細胞處理組 A: Positive control (BHK-21 group)； B: Negative control (CEF cell group)； C: ST cell group; D: PK-15 cell group; E: McCoy cell group; F: Marc-145 cell group; G: MDBK cell group; H: OA3.Ts cell group圖1 裸鼠大體解剖學檢查Fig 1 The gross anatomy examination of the nude mice

至12周，對各組剩余裸鼠進行剖檢并對注射部位皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟進行組織切片檢測，均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。在35日觀察期內，注射Marc-145、McCoy、PK15細胞的3組裸鼠均出現(xiàn)精神萎頓、采食量下降，接種部位有可疑腫塊組織。PK15、Marc-145接種組腫塊直徑2～8 mm(圖1D、圖1F)；McCoy細胞接種組腫塊直徑5～15 mm，有豐富的血管組織且部分表皮破潰(圖1E)。對3個處理組的取樣腫塊分別進行組織切片檢測，均發(fā)現(xiàn)廣泛病理性核分裂象，為鱗狀細胞癌細胞(圖2C、圖2D、圖2E)。此外，3個處理組裸鼠肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均無明顯結節(jié)和病理變化。

A：BHK-21細胞陽性對照組注射部位腫塊；B：BHK-21細胞陽性對照組肺部轉移瘤；C：Marc-145細胞處理組 注射部位腫塊 D：McCoy細胞處理組注射部位腫塊；E: PK-15細胞處理組注射部位腫塊 A: Positive control (BHK-21 group)； B: BHK-21 cell positive control group lung metastasis; C: Mass at injection site in Marc-145 cell treatment group; D: Mass at injection site in McCoy cell treatment group; E: Mass at injection site in PK-15 cell treatment group圖2 陽性對照組、處理組可疑腫塊病理切片檢查 HE 400×Fig 2 Histopathological examination of suspicious mass in positive control group and treatment group

3 討論與結論

傳代細胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織的細胞轉化而來[2]，在轉化的過程中會獲得與原始細胞不同的生物學特性，如：細胞中染色體的數(shù)量或是結構發(fā)生改變；細胞錨定依賴性的消失以及細胞致瘤性的發(fā)生。根據(jù)以上特性，可將轉化可分為一般轉化和惡性轉化。一般轉化細胞培養(yǎng)時伸展良好、有方向性、接觸抑制且具有錨定依賴性，無致瘤性。惡性轉化細胞培養(yǎng)時細胞伸展性差、接觸抑制消失，并不具備錨定依賴性，可在軟瓊脂內增殖，接種裸鼠皮下可致瘤[9-10]。隨著傳代細胞系在生物制品領域的廣泛應用，致瘤性陽性的傳代細胞系能否作為生產用細胞基質及其對生物制品安全性的影響逐漸成為疫苗研發(fā)、評審、監(jiān)管機構關心和討論的問題[11]。

2015版《中華人民共和國獸藥典》在使用動物體內接種法評價生產用細胞基質的致瘤性時，主要檢查接種待檢細胞的活培養(yǎng)物在動物體內是否成瘤，其目的是為了確定細胞基質接種動物后形成(腫)瘤的能力，檢查細胞系動物體內成瘤的特性。本研究針對6種細胞的基礎代次進行了致瘤性檢查，結果表明：MDBK細胞、OA3.Ts細胞、ST細胞不會引起裸鼠發(fā)生腫瘤，具有良好的安全性。由于某些細胞傳代次數(shù)增加會增加致瘤風險[1]，因此以上三種細胞用于生物制品的研發(fā)或生產時，還應對其限定的生產最高代次細胞進行致瘤性檢查，以確保傳代的過程不會增強細胞致瘤性。McCoy細胞、PK-15細胞、Marc-145細胞基礎代次致瘤性檢查呈陽性，用于獸用滅活疫苗的生產時，應進行適當處理，如凍融或超聲波裂解細胞[12]，使用β-丙內酯或二乙烯亞胺降解細胞核酸[13]，超濾去除細胞碎片等，以減低細胞致瘤風險。

為了保證疫苗的安全性，應盡可能使用低代次的細胞用于疫苗生產，參考WHO 相關指南、《歐洲藥典》、《中國藥典》三部，建議在細胞系生產的疫苗質量標準中增加細胞DNA 殘留量限定標準，降低細胞性致瘤性和致癌性的風險。從長遠來講，解決問題的最佳辦法是開發(fā)無致瘤性細胞系。