土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺高效液相色譜檢測方法的研究

馬文瑾，徐向月，毛倩，安博宇，霍美霞，王涵宇， 陶燕飛，2，劉振利，2，黃玲利，2*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)F)，又名氟甲砜霉素，是氯霉素類第三代廣譜抗菌藥。因其高活性，低毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，在中國的銷量呈逐年上升趨勢，2010年至2017年氟苯尼考銷售量從1489.41噸增加至3771.9噸[1]。歐洲藥品管理局(The European Agency，EMA)發(fā)表的報(bào)告中提出，通過肌肉注射方式按照20 mg/kg的劑量，間隔48 h連續(xù)兩次給豬給予氟苯尼考藥物后，約有45%～60%的氟苯尼考通過尿液排出，而尿中排出的代謝物氟苯尼考胺(Florfenicol amine，F(xiàn)FA)占11.2%～17%，氟苯尼考草氨酸占<10%，氟苯尼考醇占1.1%，單氯氟苯尼考占1.9%，約有24%氟苯尼考通過糞便排出[2]。因此，臨床使用氟苯尼考，動(dòng)物經(jīng)過代謝排泄進(jìn)入環(huán)境的藥物主要為氟苯尼考和氟苯尼考胺(圖1)。

圖1 氟苯尼考(a)和氟苯尼考胺(b)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structural formula of florfenicol (a) and florfenicol amine (b)

氟苯尼考在國內(nèi)使用廣泛，隨動(dòng)物排泄進(jìn)入環(huán)境的量在不斷增加，對(duì)環(huán)境安全性存在較大威脅。氟苯尼考對(duì)環(huán)境的污染現(xiàn)狀在國內(nèi)外相繼被報(bào)道，但大多是水環(huán)境中的暴露量，土壤中的報(bào)道幾乎空白[3-5]。氟苯尼考的辛醇-水分配系數(shù)(logKow)值為0.37，表明其與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合的可能性很低，當(dāng)氟苯尼考通過糞便進(jìn)入土壤后，在土壤中具有很高的流動(dòng)性，容易到達(dá)地表水和地下水造成污染[6]，并且高濃度的氟苯尼考對(duì)土壤中微生物的呼吸作用具有明顯的抑制作用[7]。因此，研究氟苯尼考在土壤中的暴露量至關(guān)重要。在氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢測中，主要分析對(duì)象為動(dòng)物性產(chǎn)品，應(yīng)用方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法以及免疫化學(xué)技術(shù)[8-12]。同時(shí)檢測土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法報(bào)道較少，多為氟苯尼考的檢測，應(yīng)用方法主要為高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法[13-14]。本研究旨在建立一種高效、節(jié)約、靈敏的同時(shí)檢測土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺的高效液相色譜分析方法，為檢測土壤中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺暴露量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 Waters2996高效液相色譜儀，配備Waters2998光電二極管陣列檢測器(PDA)、購自美國Waters公司；色譜柱Agilent SB-C18(250×4.6 mm，5 μm)；電子分析天平(0.00001 g)，型號(hào)AUW2200，購自日本島津；超聲波清洗儀，型號(hào)KQ-3200，購自昆山市超聲儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速20000 r/min，HITACHI CR21G，購自日立公司； MilliporeR純化水系統(tǒng)，購自美國Milli-Q公司。

1.2 材料與試劑

1.2.1 藥物 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(含量：99.8%，規(guī)格：0.25 g/瓶)，購自德國 Dr.Ehrensorfer公司；氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品(含量：99.8%，規(guī)格：100 mg/瓶)，購自德國WITEGA公司。

1.2.2 樣品 壤土，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻田邊土壤。砂壤土，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山土壤。砂土，采自武漢白沙洲旁農(nóng)田邊土壤。均使用多點(diǎn)采樣方法從表層土壤的頂部0～20 cm收集三個(gè)子樣本，混合在一起以獲得復(fù)合樣本，自然風(fēng)干，其中一部分過2 mm篩用于土壤實(shí)驗(yàn)，另一部分過1 mm篩用于測定土壤的基本理化形式。將三種土壤用 1.3項(xiàng)樣品前處理方法提取后供HPLC檢測，均未檢測出氟苯尼考及氟苯尼考胺。

1.2.3 主要試劑 甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Grace公司；磷酸、丙酮、二氯甲烷、氨水均為分析純，磷酸二氫鈉、十二烷基硫酸鈉、氯化鈉均為化學(xué)純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品5.01 mg置于5.00 mL容量瓶中，加入5.00 mL甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成1000 mg/L的FF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃冷藏備用。

氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品5.01 mg置于5.00 mL容量瓶中，加入0.50 mL超純水溶解，再加入甲醇定容至刻度，搖勻，配制成1000 mg/L的FFA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃冷藏備用。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液可穩(wěn)定保存三個(gè)月的時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)混合工作液的配制需要根據(jù)儲(chǔ)備液現(xiàn)配現(xiàn)用。

流動(dòng)相A磷酸二氫鈉溶液(0.01 mol/L，含0.005 mol/L十二烷基硫酸鈉，pH=4.4)的配制：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鈉7.8 g、十二烷基硫酸鈉7.2 g，溶于500 mL超純水中，用85%磷酸調(diào)pH至4.4，經(jīng)0.2 μm PVDF微孔過濾膜(水系)真空抽濾。

1.3 樣品前處理 分別稱取三種空白土壤樣品(1±0.1) g于10 mL離心管中，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。分別加入1 mL的超純水和4 mL丙酮，渦旋3 min，超聲波震蕩10 min，8000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。再用同樣方法重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。向合并上清液中加入2 mL的4% NaCl溶液，300 μL的25%氨水，10 mL的二氯甲烷，進(jìn)行液液萃取，渦旋3 min，5000 r/min離心5 min，棄去上層水相。將下層有機(jī)相置于氮吹儀上吹干(水浴溫度50 ℃以下)。氮?dú)獯蹈珊笥? mL初始流動(dòng)相復(fù)溶解，渦旋3 min，溶液過0.22 μm針筒式濾膜過濾器至進(jìn)樣瓶，供HPLC分析。

1.4 高效液相色譜條件 流動(dòng)相A：磷酸二氫鈉溶液；流動(dòng)相B：乙腈；檢測器：光電二極管陣列檢測器；檢測波長：225 nm;色譜柱：Agilent SB-C18(250x4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min，等度洗脫：65%A：35%B；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用初始流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)混合工作液依次稀釋成濃度為0.025、0.05、0.1、0.5、5 mg/L，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，過0.22 μm濾膜，供HPLC分析，以藥物濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.6 添加回收率和精密度測定 三種空白土樣中分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，藥物濃度為0.05、0.1、0.2 mg/ kg，每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)，按1.3項(xiàng)樣品前處理方法處理樣品后供HPLC檢測，根據(jù)峰面積和公式(1)計(jì)算回收率和日內(nèi)變異系數(shù)，連續(xù)檢測3 d計(jì)算日間變異系數(shù)。公式(1)如下：

(1)

式中，X：試樣中待測物回收率；A：加標(biāo)提取試樣的峰面積；As：提取后加標(biāo)試樣的峰面積；W：試樣體積(mL)；V：待測提取液的總體積(mL)。

1.7 檢測限和定量限測定 按1.3項(xiàng)樣品前處理方法制備空白土壤樣品提取液，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成系列低濃度樣品供HPLC分析，對(duì)每種濃度測定5次，記錄每次測得的信號(hào)強(qiáng)度S與噪音強(qiáng)度N。取平均值得出S和N，以S/N=3時(shí)樣品的最低濃度為檢測限(LOD)，S/N=10時(shí)樣品的最低濃度為定量限(LOQ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 在優(yōu)化的色譜條件下，測得土壤樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺保留時(shí)間分別約為6.13～6.25、12.43～12.64 min，2個(gè)峰間隔時(shí)間較長，色譜峰峰形較佳，且均為基線分離峰，空白土壤提取液在上述保留時(shí)間無干擾峰出現(xiàn)(圖2、圖3)。

圖2 0.2 mg/L FF、FFA混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Fig 2 FF and FFA contrast sample of 0.2 mg/L

(a:空白壤土；b: 加標(biāo)0.2 mg/kg FF、FFA壤土；c:空白砂土；d: 0.2 mg/kg FF、FFA砂土；e:空白砂壤土；f: 0.2 mg/kg FF、FFA砂壤土)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限的確定 分別以氟苯尼考、氟苯尼考胺的色譜峰面積 (A，μV/s) 對(duì)進(jìn)樣前氟苯尼考、氟苯尼考胺的質(zhì)量濃度 (C，mg/L)作圖，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟苯尼考，氟苯尼考胺皆在0.025～5 mg/L濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈線性關(guān)系，見圖4。相關(guān)系數(shù)r均能達(dá)到0.999，線性關(guān)系良好，氟苯尼考線性回歸方程為y=52.354x+309.28，氟苯尼考胺線性回歸方程為y=65.497x-959.26。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測限分別為 0.01、0.015 mg/kg，定量限分別為0.045、0.05 mg/kg(表1)。

表1 FF、FFA回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 1 The linear regression equation, correlation coefficient of FF and FFA

圖4 FF、FFA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 standard curve of FF and FFA

2.3 空白土壤樣品添加FF和FFA的回收率和精密度 在空白土壤添加適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使土壤中的氟苯尼考及氟苯尼考胺濃度為0.05、0.1、0.2 mg/kg，進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，土壤中氟苯尼考和氟苯尼考胺回收率范圍分別為95.10%～99.37%和88.77%～96.86%，砂土中氟苯尼考和氟苯尼考胺回收率范圍分別為93.34%～95.95%和87.10%～88.39%，砂壤土中氟苯尼考和氟苯尼考胺回收率范圍分別為90.16%～97.55%和67.63%～81.42%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤9.65%，日內(nèi)變異系數(shù)均≤7.83%，日間變異系數(shù)均≤10.52%，表明該方法穩(wěn)定可靠(表2)。

表2 FF、FFA不同添加濃度回收率及變異系數(shù)Tab 2 Recoveries and CV of FF and FFA in different concentration

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件優(yōu)化 高效液相色譜法檢測氟苯尼考的方法通常使用的流動(dòng)相為乙腈和水，但在本實(shí)驗(yàn)中需要同時(shí)檢測出氟苯尼考和氟苯尼考胺，氟苯尼考胺呈弱堿性，在C18反相色譜柱中幾乎不保留，目前國內(nèi)外使用的方法主要為磷酸二氫鈉與庚烷磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉組成的流動(dòng)相體系[15-17]。本試驗(yàn)采用Waters2996高效液相色譜儀，配備Waters2998光電二極管陣列檢測器檢測，激發(fā)波長225 nm，樣品雜質(zhì)峰少，干擾少，可將氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺與土壤中其他基質(zhì)完全分開。本試驗(yàn)采用了磷酸二氫鈉與十二烷基硫酸鈉作為流動(dòng)相A，其中十二烷基硫酸鈉與氟苯尼考胺生成弱極性離子對(duì)，進(jìn)一步推遲氟苯尼考胺的出峰時(shí)間，乙腈作為流動(dòng)相B。根據(jù)參考文獻(xiàn)[16,18-19]在流速為0.8 mL/min的條件下探討了流動(dòng)相A∶B的比例，對(duì)比了在A ∶B比例為70 ∶30、68 ∶32、65 ∶35時(shí)藥物的分離度，發(fā)現(xiàn)在A ∶B=65 ∶35時(shí)，兩待測物響應(yīng)值較高，分離度較好，并且發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相A的pH值對(duì)試驗(yàn)影響較大，本實(shí)驗(yàn)用磷酸調(diào)節(jié)pH，對(duì)比了pH在3.8、4.4、5.2時(shí)對(duì)色譜檢測的影響，發(fā)現(xiàn)在pH為4.4±0.1時(shí)，待測物與雜質(zhì)分離度較好。

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化 目前，國內(nèi)外關(guān)于氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺的提取方法有許多報(bào)道，提取劑一般為氨化乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮等。參考文獻(xiàn)[7,20-22]，本試驗(yàn)比較了不同提取劑(A:磷酸鹽緩沖液+ Na2EDTA；B：水+乙腈；C：氨水+乙酸乙酯+乙腈；D：水+丙酮)對(duì)土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺提取效率的影響， 結(jié)果表明：A和B試劑提取效率較差，提取不出氟苯尼考胺，回收率較低；C試劑提取效率相對(duì)較高，但同時(shí)也帶進(jìn)了許多內(nèi)源性物質(zhì)，凈化過程較為復(fù)雜；D試劑提取效果好，回收率相對(duì)較高，而且提取出的內(nèi)源性物質(zhì)少，減少了雜峰干擾。

本研究比較了不同凈化方法的凈化效果，對(duì)比了HLB和MCX兩種固相萃取小柱和二氯甲烷液液萃取凈化效果，發(fā)現(xiàn)HLB小柱凈化后只能洗脫出FF，MCX能同時(shí)洗脫出FF和FFA，但凈化過程復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間長，經(jīng)過兩次氮吹后損失較多，并且在色譜圖前段出現(xiàn)雜峰與氟苯尼考分離度較低，出現(xiàn)干擾峰。而二氯甲烷液液萃取簡化了樣品凈化步驟，減少損失，大大節(jié)省了樣品前處理成本，能很好地凈化雜質(zhì)。在液液萃取過程中，加入4%NaCl，利用鹽析法增加丙酮與水的分離度，使水相中的丙酮完全析出，加入氨水使弱堿性的FFA以非解離形式存在，提高其回收率[18]。目前國內(nèi)外對(duì)土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺的提取使用水、丙酮和二氯甲烷提取的報(bào)道較少，本試驗(yàn)在空白土壤樣品中添加不同濃度的氟苯尼考和氟苯尼考胺工作液，測得土壤樣品中FF和FFA平均回收率較高，符合測定要求，該檢測方法靈敏，滿足土壤樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留檢測的要求，方法簡便、快速、易行，可進(jìn)一步推廣。

高效液相色譜法檢測土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺，采用丙酮和水提取，二氯甲烷液-液萃取，氟苯尼考及氟苯尼考胺在三種土壤樣品中的加標(biāo)回收率分別為90.16%～99.37%、67.63%～96.86%，日內(nèi)變異系數(shù)均≤7.83%，日間變異系數(shù)均≤10.52%，滿足定量分析方法學(xué)要求，且該方法高效快速，檢測成本低，可作為氟苯尼考及氟苯尼考胺在土壤中暴露量檢測的參考技術(shù)手段。