海南霉素鈉預(yù)混劑在雞體內(nèi)的藥動學(xué)及生物利用度研究

王美紅，郭桂芳，聶貞，張小龍，蔣玥，顧夢恬*，卜仕金*

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009； 2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 3. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

海南霉素是從稠李鏈霉菌東方變種的代謝產(chǎn)物中提取出來的聚醚類抗生素[1]，主要用于雞球蟲病的防治，其市售產(chǎn)品為1%海南霉素鈉預(yù)混劑，經(jīng)農(nóng)業(yè)部核準的推薦治療劑量為7.5 ppm。據(jù)報道，海南霉素鈉預(yù)混劑對雞球蟲病防治效果良好[2-3]，同時還具有促增重和提高飼料利用率的作用[4]。然而聚醚類藥物的毒性較大、安全范圍較窄，此類藥物使用不合理會導(dǎo)致雞中毒和獸藥殘留，威脅人類健康[5]。盡管海南霉素已經(jīng)上市十多年，國內(nèi)外關(guān)于海南霉素的報道主要是關(guān)于其療效、毒性和對動物生長性能影響等方面的研究，而關(guān)于其檢測分析的發(fā)表論文僅有四篇[6-9]，其中Wang等[9]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測了飼料中海南霉素的含量。常用聚醚類抗球蟲藥藥動學(xué)的報道已見于莫能菌素[10-11]，其中Henri等[10]研究了莫能菌素在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)。有關(guān)海南霉素在動物組織和血漿中含量的檢測方法以及在雞體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物利用度方面的研究未見報道。目前在對動物源性產(chǎn)品的幾種主要的聚醚類抗生素含量的檢測中,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)使用廣泛且高效[12]，采用HPLC-MS/MS檢測方法已見相關(guān)報道[13-15]。有鑒于此，建立一種測定雞血漿中海南霉素含量的HPLC-MS/MS檢測方法，并開展海南霉素鈉預(yù)混劑在雞體內(nèi)的藥動學(xué)和生物利用度研究，不僅對指導(dǎo)臨床合理用藥、預(yù)測藥物在雞體內(nèi)的消除動態(tài)、蓄積特性和殘留消除規(guī)律等具有一定的參考價值，同時對豐富和完善國產(chǎn)一類新獸藥的臨床藥理學(xué)資料具有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 海南霉素對照品(純度>99.87%)、1%海南霉素鈉預(yù)混劑(批號HNP11702006)，均由山東勝利生物工程有限公司惠贈；甲醇、乙腈為色譜級，購自美國TEDIA公司；甲酸為色譜級，購自東京化成工業(yè)株式會社；乙酸銨為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 AB SCIEX 三重四級5500系統(tǒng)，含串聯(lián)(TQ)四級桿Mass檢測器和Analyst軟件；Waters 2695 HPLC 高效液相色譜儀；Ultimate XB-C18色譜柱(1.8 μm, 2.1×100 mm)；Pacific RO 純水儀，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；超生波清洗器，德國Elma Elmasonic P 專業(yè)級；氮吹儀，美國Organomation公司；Genius23010、ABN2ZA氮氣發(fā)生器，英國Peak Scientific公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機，上?？蠌妰x器有限公司；SI可調(diào)速漩渦混合器，上海思伯明儀器設(shè)備有限公司；可調(diào)微量移液器。

1.1.3 溶液的配制

1.1.3.1 流動相 將乙腈和0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)按90 ∶10(V/V)的比例混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，并通過超聲脫氣處理,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3.2 海南霉素標準液和工作液的配制 海南霉素標準儲備液：準確稱量約10 mg海南霉素標準品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備濃度為1 mg/mL海南霉素標準儲備液。

海南霉素工作液：準確吸取適量的海南霉素標準儲備液，用甲醇稀釋成濃度為1 μg/mL海南霉素工作液，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3.3 海南霉素鈉注射液 準確稱取一定量的海南霉素鈉對照品加入適量甲醇溶解后，用滅菌注射用水稀釋成1%溶液，供靜脈注射用。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 試驗動物 3月齡的健康A(chǔ)A雞16只，平均體重約3 kg，由江蘇八達畜禽有限公司提供。受試雞采用翅標標識。試驗前受試動物至少2周內(nèi)未使用過相關(guān)藥物，并經(jīng)過至少1周適應(yīng)期。試驗期間受試動物按常規(guī)條件飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為不添加任何藥物的全價飼料。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥及血樣采集 16只體重相近的健康A(chǔ)A雞隨機分成2組，每組各8只，在給藥前一天采集空白血液。第1組1～8號雞單劑量經(jīng)口灌服1.5 mg/kg bw的海南霉素鈉預(yù)混劑受試品，第2組9～16號雞單劑量靜脈注射1.5 mg/kg bw的海南霉素鈉注射液。給藥后分別于10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、16 h、24 h各采集血樣一次，每次采血量約2～4 mL 左右。血樣采集后置于經(jīng)肝素浸潤并60 ℃烘干的10 mL離心管內(nèi)，混勻后離心，分離血漿后于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿中海南霉素含量的測定 血漿樣品中海南霉素的含量采用經(jīng)驗證的 HPLC-MS/MS 法測定。準確吸取0.5 mL新鮮或凍融的血漿樣品于10 mL離心管中，加入2 mL甲醇-乙腈(50∶50，V/V)，渦旋振蕩2 min，超聲10 min，10000 r/min離心10 min。上清液移至10 mL刻度離心管中，40 ℃氮吹至干。殘渣用1 mL甲醇溶解，渦旋振蕩2 min，10000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，濾液轉(zhuǎn)移至高效液相色譜系統(tǒng)的自動進樣瓶中供HPLC分析測定。

色譜條件為：色譜柱Ultimate XB-C18(1.8 μm，2.1×100 mm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(90∶10,V/V)；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；串聯(lián)(TQ)四級桿Mass檢測器；噴霧電壓5500.0 V；氣簾氣壓力20.0 psi；碰撞室壓力8 psi。離子化(離子源)溫度：450.0℃。根據(jù)海南霉素一級質(zhì)譜掃描和二級質(zhì)譜掃描，確定定量離子為845.6m/z,定性離子為863.6m/z,碰撞能量均為32 eV,去簇電壓為50.0 V。

準確度和精密度通過空白血樣添加海南霉素質(zhì)控樣品的回收率和平行血樣添加海南霉素質(zhì)控樣品的變異系數(shù)進行評價。

1.2.3 給藥后血漿樣品中海南霉素含量的測定 將各時間點采集的血漿樣品分別按1.2.2項血漿樣品處理方法處理后，采用HPLC-MS/MS檢測方法進行測定，獲得海南霉素的峰面積，并用隨行標準曲線回歸方程計算出各時間點血漿樣品中海南霉素的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 分別將各個動物的實測血漿藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，采用Winnonlin5.2藥動學(xué)分析軟件擬合藥動學(xué)參數(shù)，并計算出各組動物平均藥代動力學(xué)參數(shù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析比較。生物利用度的計算按以下公式：

式中F：生物利用度；AUCpo：口服藥時曲線下面積；AUCiv：靜注藥時曲線下面積；Div：靜注給藥劑量；Dpo：口服給藥劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞血漿中海南霉素含量測定的HPLC-MS/MS方法學(xué)驗證 如圖1～圖3所示，在本實驗建立的HPLC-MS/MS條件下,海南霉素的出峰時間約為5.58 min,待測組分能與溶劑峰以及血漿中其他基質(zhì)組分完全分開。海南霉素在1～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999)，檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.5 ng/mL和1 ng/mL；海南霉素在低、中及高濃度下相對回收率在94%～101%之間；批間變異系數(shù)與各批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。

圖1 海南霉素標準液(10 ng·mL-1)總離子流圖Fig 1 Total ion flow diagram of Hainanmycin (10 ng·mL-1) in standard sample

圖2 空白血漿總離子流色譜圖Fig 2 Total ion flow diagram of chicken blank plasma

圖3 空白血漿中添加海南霉素(10 ng·mL-1)總離子流色譜圖Fig 3 Total ion flow diagram of Hainanmycin(10 ng·mL-1)in blank plasma

2.2 藥動學(xué)參數(shù) 按1.5 mg/kg bw單劑量經(jīng)靜脈注射和口服給藥后的平均血藥濃度-時間曲線分別見圖4和圖5，藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。由表1知，靜脈注射給藥后海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)和平均滯留時間(MRT)分別約為46.31 h和3.31 h，平均血漿清除率(CL)約為0.58 L/(kg·h)，平均表觀分布容積(Vd)約為35.52 L/kg；口服給藥后海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)約為30.21 h，平均滯留時間(MRT)約為8.78 h，在血漿中的達峰時間(Tmax)約為0.5 h，達峰濃度(Cmax)約為68.87 ng/mL，平均藥時曲線下面積(AUC)約為318.93 ng·h/mL,平均生物利用度(F)約為 32.82%。

圖4 單劑量靜注海南霉素鈉注射液后的平均藥時曲線圖Fig 4 Average plasma concentration-time curve after single dose intravenous injection premix

圖5 單劑量口服海南霉素鈉預(yù)混劑后的平均藥時曲線圖Fig 5 Average plasma concentration-time curve after single dose oral administration of Hainanmycin sodium premix

表1 單劑量靜注海南霉素鈉注射液和口服 海南霉素鈉預(yù)混劑后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of single dose intravenous injection and oral administration of Hainanmycin sodium premix

3 討論與結(jié)論

3.1 雞單劑量靜注海南霉素鈉注射液后的藥動學(xué)特征 在Henri等[10]關(guān)于莫能菌素在雞體內(nèi)的藥動學(xué)和殘留研究中，靜注組(0.46 mg/kg bw)的平均消除半衰期(T1/2β)約為11.26 h，平均滯留時間(MRT)約為10 h，平均血漿清除率(CL)約為1.77 L/(kg·h)，平均表觀分布容積(Vd)約為14.05 L/kg，該藥物在雞體內(nèi)分布較為局限、消除較快，給藥6 h后在除脂肪外的其他基質(zhì)中均無法檢測到殘留。而在本研究中，雞單劑量靜注(1.5 mg/kg bw)海南霉素鈉注射液后，海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)約為46.40 h，平均滯留時間(MRT)約為30.91 h，平均血漿清除率(CL)約為1.59 L/(kg·h)，平均表觀分布容積(Vd)約為116.05 L/kg，表明海南霉素在雞體內(nèi)分布廣泛、消除緩慢，其容易在雞體內(nèi)蓄積。

3.2 雞單劑量口服海南霉素鈉預(yù)混劑后的藥動學(xué)特征 雞單劑量口服(1.5 mg/kg bw)海南霉素預(yù)混劑后，達峰時間(Tmax)和達峰濃度(Cmax)分別約為0.5 h和68.87 ng/mL，表明雞口服海南霉素鈉預(yù)混劑后吸收較迅速；海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)約為30.44 h，平均滯留時間(MRT)約為36.40 h，消除速度相對較慢；平均藥時曲線下面積(AUC)約為654.95 ng·h/mL，生物利用度(F)約為32.82%，表明海南霉素口服給藥吸收不完全，進入雞體內(nèi)的海南霉素量較低。類似的研究結(jié)果見于Henri等[10]關(guān)于莫能菌素藥動學(xué)研究報道中，莫能菌素口服(4 mg/kg bw)在雞體內(nèi)的生物利用度(F)約為30%，使用非線性混合效應(yīng)模型評估時生物利用度(F)約為11.36%，但Henri等[10]亦表明使用非線性混合效應(yīng)模型評估時的藥動學(xué)變量似乎不準確。由于海南霉素是在腸道中發(fā)揮抗球蟲的作用，且海南霉素毒性較大，較低生物利用度不僅有益于其抗球蟲作用，而且對減少其毒副作用也是有利的。鑒于海南霉素在雞體內(nèi)消除緩慢，因此，在生產(chǎn)實踐中，要嚴格控制劑量和用藥時間，以免長期或大劑量連續(xù)用藥產(chǎn)生的蓄積毒性。