輻照對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA的降解研究

杜 艷，陳復(fù)生，陳 晨

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

轉(zhuǎn)基因作物是指通過基因改造生產(chǎn)的作物，又稱基因改造生物(Genetically modified organisms)、基因工程作物(Genetically engineered crops)、生物技術(shù)植物(Biotech plants)等。1994年，Monsanto公司開發(fā)的抗草甘膦(Roundup Ready，RR)轉(zhuǎn)基因大豆獲FDA批準(zhǔn)，成為較早大規(guī)模商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物之一[1]。目前，轉(zhuǎn)基因作物已在全球得到大面積推廣，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心(ISAAA)統(tǒng)計，2018年世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)1.917億hm2，是1996年的(170萬hm2)113倍。其中轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積(9 590萬hm2)最大，占所有轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%左右，是世界上非轉(zhuǎn)基因大豆種植面積的3.6倍[2]。

轉(zhuǎn)基因作物具有改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、減輕病蟲害、降低生產(chǎn)成本、提高農(nóng)民收入等優(yōu)勢。1996—2016年的21年間，轉(zhuǎn)基因作物總產(chǎn)量6.58億t，累計為農(nóng)民增收1 861億美元，減少了2.71億t的CO2排放量[3]。但由于轉(zhuǎn)基因作物突破了物種之間的界限，引入非植物本體自然進(jìn)化得到的基因，使得轉(zhuǎn)基因食品的安全性始終存在很大爭議[4-5]。

王衛(wèi)國等[6]認(rèn)為，食品加工過程中的物理、化學(xué)等處理方式可以有效減少甚至去除轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源基因，從而降低轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全隱患。Tian等[7]研究表明，將RR大豆DNA置于90 ℃加熱15 min，大豆內(nèi)源lectin基因919 bp以上片段擴增結(jié)果呈陰性。絕對定量結(jié)果顯示，隨著加熱時間的延長，RR大豆內(nèi)源lectin和外源cp4epsps基因的拷貝數(shù)均發(fā)生下降[8]。經(jīng)微波處理之后，RR大豆DNA可擴增的片段長度明顯下降，內(nèi)外源基因均發(fā)生嚴(yán)重降解[9]。

輻照技術(shù)是20世紀(jì)發(fā)展起來的一種食品處理技術(shù)。電子加速器或放射性同位素等釋放出的高能射線，可以使蛋白質(zhì)等物質(zhì)的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，降解生成小分子，從而達(dá)到殺菌、降低過敏原的致敏性、脫除毒素、降解農(nóng)藥殘留等效果[10]。與此同時，輻照也可以直接作用于DNA或通過細(xì)胞中產(chǎn)生的自由基間接作用于DNA[11]，引起雙鏈DNA的改性[12]或斷裂[13]，造成動物[14]和植物[15]的DNA損傷，且隨著輻照劑量的增加，DNA損傷程度逐漸加深[16]。

因此，本研究以RR大豆籽粒、大豆粉為對象，分別采用劑量為0、4、10 kGy的Co60γ-射線進(jìn)行輻照，提取樣品中的DNA，通過DNA的質(zhì)量濃度，基因組DNA(gDNA)的完整性和分子量，以及外源基因片段長度和拷貝數(shù)的變化情況，監(jiān)測輻照過程中RR大豆DNA的降解規(guī)律。為輻照在RR大豆外源基因降解方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)，進(jìn)一步促進(jìn)RR大豆的合理、健康利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RR大豆：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院；DNeasy Plant Mini Kit(目錄號：69104)：德國Qiagen公司；瓊脂糖M、4S Green Plus核酸染色劑：上海生工生物工程股份有限公司；10×Loading Buffer：北京Solarbio科技有限公司；2×PremixTaq：日本TaKaRa公司；λ DNA/Hind III Marker、Marker D2000 DNA：北京Tiangen生化科技有限公司；ddPCR Supermix for Probes、Droplet Generation Oil、Droplet Reader Oil：美國Bio-Rad公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW型分析天平：德國Sartorius公司；Thermo Scientific Sorvall BIOFUGE Stratos全能臺式高速離心機、Nanodrop 2000微量紫外-分光光度計：美國Thermo Fisher 公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、UV light tray Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、QX200微滴發(fā)生器、QX200微滴分析儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的輻照處理

分別稱取20 g完整的RR大豆籽粒和20 g RR大豆粉(過60目篩)，包裝于聚乙烯自封袋中，作為初始樣品采用河南省科學(xué)院輻照工程技術(shù)中心的Co60γ-射線進(jìn)行輻照，輻照劑量分別為0、4、10 kGy，每個劑量進(jìn)行3次重復(fù)試驗。

1.3.2 樣品DNA提取及質(zhì)量濃度和純度檢測

將輻照后的完整RR大豆籽粒粉碎，過60目篩。采用DNeasy Plant Mini Kit提取各粉狀樣品中的DNA[17]。用Nanodrop 2000微量紫外-分光光度計測定各DNA樣品的質(zhì)量濃度和純度。

1.3.3 gDNA分子完整性檢測

將0.6 g瓊脂糖溶于60 mL 0.5×TBE緩沖液中制得質(zhì)量濃度約為0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠。取9 μL DNA溶液與1 μL 10×Loading Buffer混合均勻后點樣，于80 V恒壓條件下電泳1 h。使用UV light tray Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)對DNA擴增結(jié)果進(jìn)行拍照和觀察[17]。

1.3.4 gDNA分子量分析

將經(jīng)過不同劑量輻照的RR大豆和大豆粉的gDNA瓊脂糖凝膠電泳圖導(dǎo)入Gel-Pro Analyzer軟件，根據(jù)目的條帶與Marker的分子量比對結(jié)果，得出目的條帶所對應(yīng)的gDNA分子量。

1.3.5 內(nèi)源lectin和外源cp4epsps基因的定性PCR檢測

分別對內(nèi)源lectin基因1 487 bp和外源cp4epsps基因1 512 bp進(jìn)行擴增。定性PCR體系包含2×PremixTaq12.5 μL，上下游引物(表1)各0.4 μmol/L，模板DNA 50 ng，最后用無菌水補足體積至25 μL。定性PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃保持5 min；然后95 ℃保持30 s后，在54 ℃保持30 s，再在72 ℃保持90 s，循環(huán)35次；最后在72 ℃保持10 min。

1.3.6 輻照RR大豆粉外源cp4epsps基因的數(shù)字PCR檢測

以不同劑量輻照后的RR大豆粉DNA為模板，對外源cp4epsps基因87 bp進(jìn)行擴增。數(shù)字PCR體系包含2×ddPCR Supermix for Probes 10 μL，上下游引物(表2)各0.9 μmol/L，探針0.25 μmol/L，模板DNA 1 μL，最后用無菌水補足體積至20 μL。數(shù)字PCR反應(yīng)體系如下：95 ℃保持10 min預(yù)變性；95 ℃保持30 s變性后，在60 ℃保持60 s進(jìn)行退火和延伸，此過程循環(huán)40次；最后在98 ℃保持10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將樣本放入QX200 Droplet微滴分析儀中，進(jìn)行微滴分析檢測和結(jié)果判讀。

表2 cp4 epsps基因數(shù)字PCR的擴增引物和探針序列

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，試驗數(shù)值之間以Duncan法(P<0.05)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin8.5軟件對試驗結(jié)果作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對RR大豆、大豆粉中DNA質(zhì)量濃度的影響

經(jīng)不同劑量輻照后的RR大豆籽粒、大豆粉中DNA質(zhì)量濃度和純度如表3所示。由于DNA提取所用的樣品質(zhì)量均為0.1 g，此處的DNA的質(zhì)量濃度可反映等量樣品中DNA含量的高低。DNA的純度主要取決于DNA溶液在260 nm和280 nm處吸光度的比值(A260/A280)以及在260 nm和230 nm處吸光度的比值(A260/A230)。DNA溶液的A260/A280值在1.8～2.0之間，表明DNA受蛋白質(zhì)、RNA和酚類等物質(zhì)的污染較??；DNA溶液的A260/A230值大于2.0，表明DNA受多糖、鹽等小分子的污染較小[17]。

表3 不同劑量輻照的RR大豆、大豆粉DNA質(zhì)量濃度和純度

由表3可知，所有樣品DNA的質(zhì)量濃度在61～75 ng/μL之間，DNA溶液的A260/A280值為1.82～1.92，A260/A230值為3.52～9.13，均符合進(jìn)一步檢測的要求。此外，不論是大豆籽粒還是大豆粉，經(jīng)過4～10 kGy的輻照后，樣品DNA的質(zhì)量濃度均發(fā)生下降，下降率為8.63%～17.03%。隨著輻照劑量的增加，DNA質(zhì)量濃度的下降率呈增加趨勢。這與Maity等[20]的研究結(jié)果一致：Co60γ-射線輻照劑量從2 kGy增加至6 kGy過程中，水稻和鷹嘴豆的總DNA含量降低13%～33%，線性擬合結(jié)果表明樣品總DNA的含量與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)，R2在0.97～0.99之間。

2.2 輻照對樣品gDNA完整性的影響

輻照前后樣品gDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

泳道M：λ DNA/Hind III Marker；泳道B：空白對照；泳道Z0、Z4、Z10分別表示RR大豆籽粒經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果；泳道F0、F4、F10分別表示RR大豆粉經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果。

gDNA條帶的亮度與gDNA的總量成正比，條帶亮度減弱表明DNA可能發(fā)生了斷裂[20]。從圖1可見，未經(jīng)輻照的RR大豆籽粒、大豆粉中g(shù)DNA的條帶亮度較強，gDNA完整性較高。隨著輻照劑量增加，大豆籽粒、大豆粉gDNA的條帶亮度均呈現(xiàn)下降趨勢，泳道出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，結(jié)合表3的DNA質(zhì)量濃度變化規(guī)律，進(jìn)一步驗證了輻照后gDNA含量降低，DNA降解，完整性下降。這可能是由于輻照過程產(chǎn)生的高能射線會直接或通過超氧自由基(·O2-)等自由基的生成間接作用于DNA的化學(xué)鍵，誘導(dǎo)DNA不穩(wěn)定性位點出現(xiàn)，誘導(dǎo)鳥嘌呤氧化，進(jìn)而造成大分子DNA的斷裂降解[11-13]。

2.3 輻照對樣品gDNA分子量的影響

為了量化輻照過程中樣品gDNA分子量的變化情況，將不同劑量輻照的RR大豆籽粒、大豆粉gDNA凝膠電泳圖導(dǎo)入Gel-Pro Analyzer軟件，輸入λDNA/Hind III Marker對應(yīng)的每一個條帶分子量大小(從上到下依次為23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564 bp)，選中待測樣品gDNA條帶所在的泳道，即得各樣品gDNA的分子量，分析結(jié)果如圖2所示。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖3同。

由圖2可見，當(dāng)輻照劑量為4、10 kGy時，輻照后的RR大豆籽粒和大豆粉gDNA分子量與未經(jīng)輻照組相比明顯降低。這表明，輻照后大豆gDNA的完整性呈下降趨勢，基因發(fā)生降解，且隨著輻照劑量的增加，降解程度加劇。輻照劑量與DNA降解程度之間的相關(guān)性在其他研究中也有報道[14]。Ryu等[16]采用DNA彗星實驗表征輻照誘導(dǎo)的擬南芥DNA損傷反應(yīng)，通過線性-二次劑量-響應(yīng)模型顯示：在0～48 Gy的低劑量輻照條件下，隨著輻照劑量的增加，DNA損傷程度先顯著增加，在6 Gy時達(dá)到飽和，后趨于穩(wěn)定。Erel等[21]和Cetinkaya等[22]分別采用0～4 kGy和0.1～1.5 kGy的γ-射線處理鵪鶉肉和柑橘類水果，結(jié)果也顯示樣品DNA降解程度隨輻照劑量的增加而加深。

輻照后RR大豆籽粒、大豆粉gDNA分子量下降率如圖3所示。當(dāng)輻照劑量相同時，大豆粉中g(shù)DNA分子量的下降率(8.85%～23.51%)明顯高于大豆籽粒(6.64%～16.17%)。這表明，與完整的大豆籽粒相比，大豆粉中的DNA更容易受到輻照的影響而發(fā)生降解。這可能是由于完整的大豆籽粒在大豆皮的包裹下，細(xì)胞完整性高，而大豆粉在粉碎的過程中會伴隨部分細(xì)胞的破裂，內(nèi)容物流出，穩(wěn)定性下降。

圖3 不同劑量輻照的RR大豆籽粒、大豆粉gDNA分子量下降率

2.4 輻照對RR大豆粉外源cp4 epsps基因拷貝數(shù)的影響

微滴式數(shù)字PCR對RR大豆粉外源cp4epsps基因的擴增結(jié)果見圖4，拷貝數(shù)分析結(jié)果見表4。

圖4 不同劑量輻照的RR大豆粉外源cp4 epsps基因87 bp數(shù)字PCR擴增結(jié)果

由表4可知，隨著輻照劑量的增加，RR大豆粉中外源cp4epsps基因的拷貝數(shù)呈下降的趨勢，而當(dāng)輻照劑量為10 kGy時，拷貝數(shù)仍在105左右。這與Villavicencio等[23]的結(jié)果類似：經(jīng)0～1 kGy的γ-射線輻照，RR大豆外源cp4epsps基因195 bp擴增結(jié)果均呈陽性。這表明，10 kGy以下的輻照可以在一定程度上造成RR大豆外源基因的降解，拷貝數(shù)降低，但降解程度有限，不會對RR大豆的定性檢測造成影響。

表4 不同劑量輻照的RR大豆粉外源cp4 epsps基因拷貝數(shù)

2.5 輻照對樣品長片段內(nèi)源lectin和外源cp4 epsps基因的影響

以不同劑量輻照后的RR大豆籽粒、大豆粉DNA為模板，分別對大豆內(nèi)源lectin基因1 487 bp和外源cp4epsps基因1 512 bp進(jìn)行擴增，電泳結(jié)果如圖5、圖6所示。

泳道M：Marker D2000 DNA；泳道B：空白對照；泳道Z0、Z4、Z10分別表示RR大豆籽粒經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果；泳道F0、F4、F10分別表示RR大豆粉經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果。(a)(b)(c)分別表示3次重復(fù)試驗。

泳道M：Marker D2000 DNA；泳道B：空白對照；泳道Z0、Z4、Z10分別表示RR大豆籽粒經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果；泳道F0、F4、F10分別表示RR大豆粉經(jīng)0、4、10 kGy輻照之后的DNA電泳結(jié)果。(a)(b)(c)分別表示3次重復(fù)試驗。

由圖5、圖6可知，所有樣品的長片段lectin和cp4epsps基因均可以得到明亮、清晰的擴增結(jié)果。這進(jìn)一步驗證，盡管輻照會引起RR大豆DNA質(zhì)量濃度和分子量的下降，可在一定程度上造成外源基因拷貝數(shù)的降低，但對其內(nèi)外源基因長片段的降解效果并不明顯。輻照不會影響RR大豆的定性檢測，但若要達(dá)到大幅降解RR大豆外源基因的目的，仍需與其他處理方式共同作用。

3 結(jié)論

綜上所述，Co60γ-射線輻照會造成RR大豆籽粒、大豆粉DNA質(zhì)量濃度和完整性的降低，隨著輻照劑量的增加，gDNA分子量下降率呈升高趨勢。RR大豆粉中的DNA比完整大豆籽粒中的DNA更易于降解，輻照劑量越高，外源cp4epsps基因拷貝數(shù)越低。但是單獨的輻照作用對內(nèi)外源基因長片段的降解效果并不明顯，在后續(xù)研究中可協(xié)同其他手段以加強外源基因的降解。