具有廣譜抑菌特性的嗜酸乳桿菌細菌素活性研究

孫華迪，蔡麗麗，陳曉靜*，冉軍艦

1.河南科技學院 新科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003 2.云南商務(wù)信息工程學校，云南 昆明 650051 3.河南科技學院 食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003

目前各類化學防腐劑的副作用逐漸被人們關(guān)注，尋找各種生物活性物質(zhì)取代化學防腐劑是食品安全領(lǐng)域亟待解決的問題。乳酸菌是應(yīng)用于多種發(fā)酵食品的安全微生物，嗜酸乳桿菌是乳酸菌的一種，屬于腸道益生菌，可以調(diào)整腸道中的菌群平衡，其分泌的細菌素對致病微生物及腐敗菌產(chǎn)生拮抗作用[1]。細菌素是一些細菌在新陳代謝過程中產(chǎn)出的一類具有活性的肽或蛋白質(zhì)[2-3]。早在20世紀20年代Gratia就發(fā)現(xiàn)V株大腸桿菌產(chǎn)生一種對Φ株大腸桿菌起拮抗作用的物質(zhì)，這類物質(zhì)被稱為大腸桿菌素[4]，但是50年后才開始在分子生物學水平上對其進行研究。因此，隨著細菌素不斷地被發(fā)現(xiàn)，按照不同的標準將其進行分類。按生產(chǎn)菌的種類不同可分為革蘭氏陽性菌細菌素和革蘭氏陰性菌細菌素兩類[5-6]；按照細菌素抑菌譜的大小可分為廣譜細菌素、中譜細菌素和窄譜細菌素[5]；按照細菌素分子量大小、熱穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)可分為復合型大分子、羊毛硫細菌素、熱敏感大分子蛋白和小分子熱穩(wěn)定肽，可簡化為是否含有羊毛硫氨酸的細菌素[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，細菌素是一種自然產(chǎn)生的蛋白類抑菌劑，它無抗藥性，滅菌快，無殘存且成本低，生產(chǎn)快速，可對食物腐敗菌起抑制或殺滅作用[9-11]。因此，它在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛。Nisin是最早應(yīng)用于食品行業(yè)中的細菌素，可以延長貨架期，并且在保質(zhì)期以內(nèi)最大程度地保持風味不變，另外，在國外消費較多的罐裝蔬菜中，Nisin經(jīng)常作為添加劑使用，不僅能起到改善口感的作用，也是防止罐裝蔬菜腐敗變質(zhì)的有效手段[12-13]。乳酸菌細菌素不僅可以有效地抑制動物體內(nèi)的致病微生物的生長繁殖，提高動物的免疫力，還可以抑制養(yǎng)殖飼料中的有害微生物的增殖，所以細菌素作為抗生素的替代品添加入養(yǎng)殖飼料中也很有前景[14-15]。另外，乳酸菌細菌素的特點使其在食品防腐方面應(yīng)用最多[16]，而且細菌素在食品工業(yè)上的應(yīng)用也在不斷拓展，可能會作為功能性食品出現(xiàn)在人們的視野中。將細菌素與食物混合,一起被人們食用，從而進入人體去改善腸道菌群，產(chǎn)生對人體有益的作用[17]；還有將細菌素與食品包裝袋或保鮮膜結(jié)合使用，即在食品包裝袋或保鮮膜上涂一層細菌素，可以在保藏或運輸過程中防止食品發(fā)生腐敗變質(zhì)或微生物污染；甚至還有科學家嘗試異源表達，通過基因?qū)氲姆绞绞鼓承┚昃哂挟a(chǎn)細菌素的能力，對有害微生物起拮抗作用，從而保證食品質(zhì)量安全[18]。另外，細菌素在人類健康方面也有新的應(yīng)用。許多科學家研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌細菌素作為一種天然的可以抑制致病菌且無抗藥性的蛋白類物質(zhì)，在口腔和皮膚護理、呼吸道感染方面有深遠的潛在影響[19]。近年來，隨著對細菌素研究的深入，其功能逐漸地被認識、了解。但細菌素在食品保藏保鮮、醫(yī)藥健康、畜牧養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用還有很大的潛力。

本研究采用的嗜酸乳桿菌是課題組自行分離保存的一株細菌(GenBank登錄號MF804413)，該菌所產(chǎn)細菌素具有良好的抑菌活性。作者對其抑菌活性和生物穩(wěn)定性進行了分析，以期為嗜酸乳桿菌ZRX02所產(chǎn)細菌素在食品防腐、藥物治療、飼料添加等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗菌株：嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)ZRX02(GenBank: MF804413)為作者所在單位實驗室保藏菌株。

指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門桿菌(Salmonella)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)。

1.2 主要試劑

乙酸乙酯、乳酸、乙酸：分析純；胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶：上海億欣生物科技有限公司；BHI培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌適用于MRS液體培養(yǎng)基。配方：檸檬酸氫二銨2 g、蛋白胨10 g、磷酸氫二鉀2 g、牛肉膏10 g、一水葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、酵母膏5 g、硫酸鎂0.58 g、吐溫80 1 mL、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.2～6.6，121 ℃滅菌30 min。

沙門桿菌、大腸桿菌、炭疽桿菌適用于LB液體培養(yǎng)基。配方：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃滅菌30 min。在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g瓊脂粉，即得LB固體培養(yǎng)基。

金黃色葡萄球菌、枯草桿菌適用于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。配方：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL、牛肉膏3 g，調(diào)pH值至7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；LYNX4000冷凍離心機：泰國Thermo公司；YRE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責任公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；95-2磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；Model PHS-3C pH儀：上海盛磁儀器有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司；SW-CJ-1D(經(jīng)濟型)單人單面垂直凈化工作臺：中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液的制備

從-80 ℃的冰箱中拿出保藏的嗜酸乳桿菌菌種，以1%的接種量將菌種接種至50 mL的MRS液體培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，即為第1次活化；將第1次活化的嗜酸乳桿菌以1%接種量接種至50 mL的MRS液體培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，即為第2次活化；然后以同樣的步驟進行第3次活化。將第3次活化后的嗜酸乳桿菌菌種以1%接種量接種至準備好的MRS液體培養(yǎng)基，在同樣的條件下進行大量培養(yǎng)。將菌種發(fā)酵液在4 ℃下，10 000 r/min離心15 min，去沉淀留上清備用[8]。

1.4.2 抑菌試驗

指示菌的培養(yǎng)：將實驗室保存的指示菌菌種以1%的接種量接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，備用。

抑菌試驗：吸取100 μL大腸桿菌均勻涂布至LB固體培養(yǎng)基上，再打直徑為6 mm的孔，將1.4.1的發(fā)酵上清液吸取100 μL加入孔內(nèi)。在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中放置約8 h后拿出，測量出現(xiàn)的抑菌圈直徑[20]。

1.4.3 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

排除發(fā)酵液中有機酸的作用：取嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)酸堿度，直至pH值為5.0。同時用乳酸、乙酸調(diào)節(jié)空白培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)至pH值為5.0作為空白對照，按1.4.2進行抑菌試驗。

排除發(fā)酵液中過氧化氫的作用：取細菌發(fā)酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至7.0，再加入過氧化氫酶使其終質(zhì)量濃度達到5 g/L，37 ℃水浴中放置2 h后取出，再將pH值調(diào)回5.0。通過牛津杯法[21]測試其抑菌效果。

1.4.4 嗜酸乳桿菌細菌素的粗提取

在前期研究的基礎(chǔ)上[22]，通過乙酸乙酯萃取的方法粗提取嗜酸乳桿菌細菌素。將發(fā)酵上清液以1∶1的體積比與乙酸乙酯混合進行萃取，萃取時間為1 h，萃取2次，棄掉下層溶液保留上層溶液，且將上層的有機相進行旋蒸。旋蒸產(chǎn)物用pH=7.0的PBS復溶，復溶比例為100∶1(即1 000 mL的細菌發(fā)酵液用10 mL的PBS復溶液復溶)。

1.4.5 嗜酸乳桿菌細菌素的抑菌譜測定

將培養(yǎng)好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、鼠李糖乳桿菌、炭疽桿菌、李斯特氏菌、枯草桿菌、植物乳桿菌、無乳鏈球菌、嗜酸乳桿菌分別吸取100 μL均勻涂布至對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，在涂布好的固體培養(yǎng)基上打直徑為6 mm的孔，將粗提的細菌素吸取100 μL接入打好的孔中。放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)約8 h取出，測量出現(xiàn)的抑菌圈直徑。

1.4.6 嗜酸乳桿菌細菌素穩(wěn)定性的測定

1.4.6.1 熱穩(wěn)定性測定

將粗提取的嗜酸乳桿菌細菌素分別置于8個離心管中，將離心管分別在-80 ℃、-20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃條件下處理30 min，室溫條件下放置30 min作為對照。待所有離心管處理完拿出冷卻后，將損失的細菌素用雙蒸水補回[22]。按1.4.2進行抑菌試驗。

1.4.6.2 酸堿穩(wěn)定性測定

將通過乙酸乙酯萃取法粗提取的細菌素分別置于8個離心管中，將離心管中的細菌素分別調(diào)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在室溫下放置24 h，再調(diào)回原來的pH值(pH=2.0)，以pH 2.0的作為對照。按1.4.2進行抑菌試驗[23]。

1.4.6.3 蛋白酶的敏感性測定

稱取胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶分別加入粗提細菌素中，使終質(zhì)量濃度達到1 g/L，混勻，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl將每個細菌素的pH值調(diào)節(jié)至對應(yīng)放入酶的最適pH值。在37 ℃條件下處理1 h，室溫下放置24 h，待反應(yīng)結(jié)束后，將pH值調(diào)回原始值。以未經(jīng)酶處理的細菌素作為對照，按1.4.2進行抑菌試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

嗜酸乳桿菌發(fā)酵后可以產(chǎn)生多種物質(zhì)，如有機酸、過氧化氫等物質(zhì)[24]，因此，抑菌物質(zhì)的初步鑒定也就是排除有機酸以及過氧化氫對抑菌效果的影響。經(jīng)過過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液比未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液抑菌效果較差，說明嗜酸乳桿菌細菌素的抑菌效果不是過氧化氫的作用。經(jīng)過乳酸、乙酸分別調(diào)節(jié)pH值為5.0的MRS培養(yǎng)基幾乎沒有抑菌效果。說明可以排除有機酸對抑菌作用的影響。

2.2 嗜酸乳桿菌細菌素的抑菌譜

由表1可知，嗜酸乳桿菌細菌素可以有效地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、炭疽桿菌、李斯特氏菌、枯草桿菌以及無乳鏈球菌，抑菌圈均達到30 mm以上，屬于廣譜細菌素。這也說明可以用嗜酸乳桿菌細菌素來抑制食源性致病菌及腐敗菌，且抑菌效果良好。

表 1 嗜酸乳桿菌細菌素的抑菌譜

2.3 嗜酸乳桿菌細菌素的穩(wěn)定性

2.3.1 嗜酸乳桿菌細菌素的熱穩(wěn)定性

嗜酸乳桿菌細菌素熱穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖1所示。隨著溫度升高抑菌活性逐漸降低，在經(jīng)過121 ℃處理30 min后，該細菌素依然保留90%的抑菌效果，說明嗜酸乳桿菌細菌素熱穩(wěn)定性良好。在經(jīng)過-80 ℃、-20 ℃處理后，抑菌效果比室溫對照的抑菌效果好，因此，低溫保藏或超低溫凍藏細菌素可以保持活性。

圖1 嗜酸乳桿菌細菌素的熱穩(wěn)定性

2.3.2 嗜酸乳桿菌細菌素的pH值穩(wěn)定性

嗜酸乳桿菌細菌素pH值穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖2所示。隨pH值的升高，嗜酸乳桿菌細菌素的抑菌活性逐漸降低。在pH 2.0時，抑菌活性最強，在pH 9.0時仍保留64%的抑菌活性。說明該細菌素對酸堿都有很好的穩(wěn)定性。

圖2 嗜酸乳桿菌細菌素的pH值穩(wěn)定性

2.3.3 嗜酸乳桿菌細菌素的蛋白酶敏感性

嗜酸乳桿菌細菌素對蛋白酶的敏感性試驗結(jié)果如圖3所示。在經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及中性蛋白酶處理后，細菌素抑菌活性分別保留73%、62%、79%、75%、73%，而經(jīng)過胃蛋白酶處理后變化不明顯。嗜酸乳桿菌細菌素對中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶較為敏感，對蛋白酶K最敏感，說明該細菌素是蛋白類物質(zhì)。

圖3 嗜酸乳桿菌細菌素的蛋白酶敏感性

3 結(jié)論

本試驗排除有機酸及過氧化氫的影響，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)。通過乙酸乙酯萃取法粗提的細菌素為廣譜細菌素，可以有效抑制一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、炭疽桿菌、無乳鏈球菌、枯草桿菌以及李斯特氏菌。嗜酸乳桿菌細菌素不僅具有良好的抑菌效果，而且具有良好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性，且對蛋白酶敏感。該細菌素經(jīng)過121 ℃處理30 min后，仍保存90%的抑菌效果；在pH=2.0時抑菌圈直徑達到32 mm，堿性條件下(pH=9.0)保留64%的抑菌活性。當嗜酸乳桿菌細菌素經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K處理后，抑菌活性仍分別保留73%、62%，在經(jīng)過其他蛋白酶處理后都有不同程度的下降。這一系列的試驗結(jié)果說明：嗜酸乳桿菌細菌素具有良好的抑菌效果、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，且對蛋白酶敏感。這些特點都有利于該細菌素在食品、醫(yī)藥等工業(yè)上的應(yīng)用。