咳嗽飛沫核攜帶病毒在病房機(jī)械通風(fēng)條件下經(jīng)空氣傳播的人工模擬技術(shù)研究

魏 方，周 婭，周 軍，朱子犁，胡璐璐，楊榮興

(1. 深圳市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所，廣東 深圳 518055； 2. 深圳前海旺盛醫(yī)療科技有限公司，廣東 深圳 518028； 3. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518036)

呼吸道傳染病患者咳嗽、打噴嚏等動作可以釋放出大量含有致病微生物的唾液顆粒，較大粒徑的唾液顆粒成為飛沫，隨呼出氣流污染周邊環(huán)境物體表面，較小粒徑的唾液顆粒在室內(nèi)空氣中迅速蒸發(fā)至平衡狀態(tài)，成為更小粒徑的飛沫核，形成呼吸道傳染病空氣傳播的來源[1]。研究[2]顯示，初始粒徑45 μm以下唾液顆粒在室內(nèi)環(huán)境下都有成為呼吸道傳染病空氣傳播的飛沫核，被易感人群吸入并引起感染發(fā)生的可能。

唾液顆粒飛沫核是否引起繼發(fā)感染還取決于所攜帶的致病微生物的種類、數(shù)量、生物活性、室內(nèi)微小氣候及易感人群個體狀況等因素。由于生物安全方面的原因，唾液顆粒飛沫核攜帶致病微生物經(jīng)空氣傳播并導(dǎo)致感染的過程無法在實(shí)地研究中重現(xiàn)，如能將使用小型人工氣候艙對噬菌體懸浮液滴生物活性進(jìn)行研究[3-5]的方法應(yīng)用到實(shí)地研究領(lǐng)域，將顯著改善經(jīng)空氣傳播傳染病的防控及應(yīng)用技術(shù)[6]。本研究在成功使用具有唾液相似非揮發(fā)性組分模擬唾液，采用可控方式制造出與咳嗽呼出唾液顆粒具有類似粒徑分布的液滴譜系的基礎(chǔ)上[7]，在模擬唾液中加入生物安全等級Ⅰ級的大腸埃希菌噬菌體T1, 在病房機(jī)械通風(fēng)條件下模擬唾液霧化，人工模擬咳嗽產(chǎn)生的飛沫，采集空氣中標(biāo)本檢測大腸埃希菌噬菌體T1，研究咳嗽產(chǎn)生的飛沫核在病房內(nèi)經(jīng)空氣傳播后攜帶病毒的存活量，以建立評估呼吸道傳染病在病房內(nèi)經(jīng)空氣傳播引起感染風(fēng)險的現(xiàn)場試驗(yàn)研究方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)施設(shè)備 現(xiàn)場試驗(yàn)在醫(yī)院病房內(nèi)進(jìn)行，病房大小為6.6 m×5.9 m×2.35 m (長×寬×高)，采用機(jī)械通風(fēng)方式，室內(nèi)氣流組織形式為典型頂送頂回形式(見圖1)，兩個四向散流送風(fēng)口及兩個回風(fēng)口均對稱設(shè)置在病房吊頂上，送風(fēng)口及回風(fēng)口大小均為0.6 m×0.6 m,試驗(yàn)中病房總送風(fēng)量設(shè)定為1 060 m3/h，約相當(dāng)于換氣11.6次/h，或每換氣1次需要311 s，室內(nèi)溫度控制在21.5℃，濕度為60.0%。

圖1 現(xiàn)場試驗(yàn)中醫(yī)院病房大小及送回風(fēng)口位置示意圖

現(xiàn)場試驗(yàn)中霧化噴嘴由計時電子觸發(fā)開關(guān)控制，每次噴霧1 s以模擬1次咳嗽，試驗(yàn)中將壓縮空氣流量控制在0.4 L/min，模擬唾液流量控制在0.3 mL/s，使每次噴霧排出的氣體量與一次咳嗽排出的氣體量[9-10]相近。為能采集到足夠數(shù)量的不同粒徑段霧化液滴用于統(tǒng)計分析，每次霧化的模擬唾液量約為咳嗽產(chǎn)生飛沫液體量[11]的8倍，相當(dāng)于同時咳嗽8次。

每次噴霧后使用粒子計數(shù)器(GRIMM model 1.108)記錄檢測點(diǎn)不同粒徑段空氣粒子數(shù)量變化數(shù)據(jù)。粒子計數(shù)器經(jīng)過廠商檢定，檢測粒徑范圍為0.3～20 μm，并被分成16個粒徑段分別記錄統(tǒng)計。每次噴霧后收集檢測點(diǎn)粒子數(shù)量變化數(shù)據(jù)360 s，與病房空氣1次換氣所需時間相當(dāng)。由于病房機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)的回風(fēng)管路安裝了高效過濾器，因此，假定噴霧產(chǎn)生的粒子不能通過機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)循環(huán)進(jìn)入病房空氣中，而試驗(yàn)中病房與外環(huán)境的空氣交換只能通過機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)。

噴霧形成的液滴所攜帶的大腸埃希菌噬菌體通過使用400孔單級安德森采樣器(SKC Quick Take-30)在檢測點(diǎn)采集空氣標(biāo)本獲得。試驗(yàn)中單極安德森采樣器由電控開關(guān)控制，采集粒徑范圍0.65～23 μm的霧化液滴。安德森采樣器經(jīng)過廠家檢定和實(shí)驗(yàn)室校準(zhǔn)，采樣空氣流量穩(wěn)定在28.3 L/min。每次噴霧后在每個檢測點(diǎn)連續(xù)采集6次空氣標(biāo)本，每次采樣持續(xù)1 min。采樣過程中安德森采樣器內(nèi)安放1只在實(shí)驗(yàn)室預(yù)先配制的培養(yǎng)皿，采樣后培養(yǎng)皿立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。

檢測在病房一角四分之一區(qū)域完成，控制及噴霧裝備設(shè)置在檢測區(qū)域?qū)菂^(qū)域，以減少對試驗(yàn)的干擾，采樣人員佩戴呼吸器以避免吸入霧化顆粒。試驗(yàn)中病房內(nèi)除試驗(yàn)裝備外未設(shè)置病床和醫(yī)療設(shè)備等其他物品，使霧化液滴在病房空氣中的擴(kuò)散僅受機(jī)械通風(fēng)氣流的影響.試驗(yàn)過程共設(shè)置4個檢測點(diǎn)，離噴嘴的水平距離均為2 m，各檢測點(diǎn)在坐標(biāo)中相對位置如圖2所示，其中P1和P2點(diǎn)位于送風(fēng)口下方，離病房地面高度分別為1.7、1.1 m，P3和P4點(diǎn)位于回風(fēng)口下方，離病房地面高度分別為1.7、1.1 m。檢測點(diǎn)離病房地面高度的選擇是模擬訪客站立或坐下時的呼吸帶高度。

圖2 現(xiàn)場試驗(yàn)醫(yī)院病房檢測點(diǎn)位置平面示意圖

1.2 大腸埃希菌噬菌體模擬唾液及空氣采樣平皿的制備 大腸埃希菌噬菌體模擬唾液的制備：將配制好的1 L模擬唾液肉湯121℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫后加入少量大腸埃希菌凍干粉(ATCC 11303)，置37℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)8 h，取1/4含菌肉湯用于安德森采樣器培養(yǎng)皿制作，在其余含菌肉湯中加入大腸埃希菌噬菌體(ATCC 11303-B1，為冷凍成品)后置37℃恒溫水浴搖床中再培養(yǎng)8 h，待大腸埃希菌噬菌體充分復(fù)制后加入試管中離心，離心后取上清液使用0.22 μm的濾膜過濾，濾液中大腸埃希菌噬菌體含量經(jīng)濃度滴定檢測達(dá)到108PFU/mL時，置4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ看维F(xiàn)場噴霧試驗(yàn)前后都對模擬唾液肉湯中的大腸埃希菌噬菌體含量進(jìn)行濃度滴定檢測，以計算霧化液滴中初始大腸埃希菌噬菌體攜帶量。

空氣采樣平皿的制備：安德森采樣器培養(yǎng)皿內(nèi)包含軟瓊脂和基層瓊脂雙層瓊脂，雙層瓊脂的組分及含量見表1。配制中先將基層瓊脂加入1 L蒸餾水中，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，取滅菌平皿，每皿倒入基層瓊脂10 mL，置室溫中待基層瓊脂凝固。將軟瓊脂加入1 L蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至45℃，將軟瓊脂裝入10 mL的滅菌試管，每支試管內(nèi)加入0.5 mL制作大腸埃希菌噬菌體模擬唾液中留取的含菌肉湯，再倒入含基層瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，搖動培養(yǎng)皿以使軟瓊脂均勻覆蓋基層瓊脂表面，待軟瓊脂凝固將培養(yǎng)皿用于現(xiàn)場空氣采樣。每次采樣后的培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)8 h，采樣過程中霧化液滴攜帶大腸埃希菌噬菌體沉降在培養(yǎng)皿軟瓊脂上并侵入大腸埃希菌宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，培養(yǎng)過程中宿主細(xì)胞死亡后細(xì)胞壁破裂釋放大量新噬菌體，繼續(xù)侵蝕周邊大腸埃希菌細(xì)胞并最終在培養(yǎng)皿軟瓊脂表面形成空斑，因此霧化液滴經(jīng)空氣擴(kuò)散后所攜帶的大腸埃希菌噬菌體數(shù)量可以通過計算空氣采樣培養(yǎng)皿軟瓊脂表面的空斑數(shù)量獲得。由于自然空氣沒有大腸埃希菌噬菌體，空氣中大腸埃希菌噬菌體本底數(shù)量可以忽略不計。

1.3 霧化液滴蒸發(fā)平衡后液滴核的粒徑計算 在典型室內(nèi)空氣相對濕度范圍內(nèi)，呼吸道分泌物由于含有糖蛋白和無機(jī)鹽離子，其霧化液滴經(jīng)蒸發(fā)作用后仍保留一定比例的水份，此時液滴表面水汽蒸發(fā)和凝結(jié)作用達(dá)到平衡形成液滴核。霧化液滴表面蒸發(fā)速率可以通過經(jīng)典液滴表面邊界層水汽壓平衡擴(kuò)散梯度公式計算[12]，霧化液滴粒徑變化時間函數(shù)d(t)表達(dá)如下：

表1 空氣采樣器培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基組分及含量

(1)

式中d0是霧化液滴初始直徑,D是水汽分子擴(kuò)散率，M是水的分子量，R是通用氣體常數(shù)，ρ是空氣密度，T是空氣溫度，P∞是空氣中的水汽壓，Ps是飽和水汽壓。由于霧化液滴非揮發(fā)性物質(zhì)組分較為復(fù)雜，公式(1)中的熱力學(xué)參數(shù)難以確定，使用質(zhì)量平衡原理假定完全脫水的液滴與其初始狀態(tài)的非揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量相同，蒸發(fā)平衡狀態(tài)的液滴核粒徑(deq)與其初始粒徑(d0)關(guān)系的簡化計算方法如下[11]：

(2)

式中Cn是呼吸道分泌物中非揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量濃度，Cn=88 g/L[8],如果使用水的密度ρn=1 000 g/L代表霧化液滴蒸發(fā)平衡時的密度[11]，咳嗽呼出飛沫蒸發(fā)平衡后的直徑約為初始直徑的0.44倍，此項(xiàng)假設(shè)建立在純水顆粒蒸發(fā)的基礎(chǔ)之上，未考慮飛沫中非揮發(fā)性物質(zhì)對粒徑變化的影響[1]，對于霧化液滴蒸發(fā)平衡后液滴核的粒徑計算，進(jìn)而計算液滴核所攜帶大腸埃希菌噬菌體存活函數(shù)有一定影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Sigmaplot V11(SPSS Inc)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 蒸發(fā)作用下霧化液滴的粒徑變化 本研究假設(shè)霧化液滴蒸發(fā)平衡后液滴核的粒徑是初始粒徑的0.4倍，則液滴核的體積是霧化液滴初始體積的6%，按此假設(shè)咳嗽飛沫不同粒徑段顆粒的平均粒徑及其蒸發(fā)平衡后的粒徑見表2。

表2 咳嗽飛沫不同粒徑段數(shù)量[12]及其蒸發(fā)前后平均粒徑

2.2 空氣中液滴核數(shù)量 可吸入粒徑范圍的液滴核達(dá)到蒸發(fā)平衡所需要的時間很短，如按照公式(1)計算45 μm初始粒徑的水滴完成蒸發(fā)的時間小于1 s。蒸發(fā)平衡后空氣中的液滴核在重力沉降、與其他空氣懸浮粒子凝結(jié)或機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)作用下去除。計算檢測到的液滴核數(shù)量時還要剔除空氣中本底粒子數(shù)，每次現(xiàn)場試驗(yàn)前使用粒子計數(shù)器記錄10 min內(nèi)病房空氣中本底粒子數(shù)量變化，檢測結(jié)果顯示病房空氣中本底粒子的平均粒徑是0.84 μm，本底粒子濃度是58 725個/L。見圖3。在圖2檢測點(diǎn)粒子計數(shù)器記錄的空氣粒子數(shù)減去空氣本底粒子數(shù)后即為該檢測點(diǎn)的液滴核數(shù)量。

圖3 試驗(yàn)病房空氣中不同粒徑段本底粒子數(shù)

2.3 可吸入液滴核的體積計算 選取檢測點(diǎn)粒子計數(shù)器記錄的安德森采樣器測量粒徑范圍內(nèi)的不同粒徑段的粒子數(shù)，分別減去對應(yīng)粒徑段的空氣本底粒子數(shù)，獲得不同粒徑段液滴核的數(shù)量，再將液滴核粒徑反推蒸發(fā)前霧化液滴初始粒徑，在任意檢測點(diǎn)(Xj)液滴核蒸發(fā)前每升空氣中霧化液滴的總體積密度函數(shù)(Vt,mL)計算如下：

(3)

式中ci是空氣中特定粒徑段液滴核的粒子濃度，vi是特定粒徑段液滴核蒸發(fā)前的霧化液滴體積，i代表任意粒徑段，n是粒徑段總數(shù)，j代表任意檢測點(diǎn)。

2.4 空氣標(biāo)本中噬菌體存活量 為驗(yàn)證噴霧機(jī)械力對液滴中噬菌體存活的影響，由計時電子觸發(fā)開關(guān)控制霧化噴嘴向無菌燒瓶內(nèi)噴霧1 s，采集燒瓶內(nèi)凝結(jié)液進(jìn)行噬菌體濃度滴定檢測，結(jié)果顯示噴霧前后噬菌體濃度在相同數(shù)量級，表明噴霧機(jī)械力對液滴中噬菌體存活影響可以忽略不計，造成液滴核內(nèi)噬菌體數(shù)量減少的主要因素是干燥和環(huán)境參數(shù)。

現(xiàn)場試驗(yàn)中4個檢測點(diǎn)空氣標(biāo)本中噬菌體存活數(shù)量隨采樣時間衰減變化特征符合回歸曲線，將回歸曲線延伸至t=0處推算液滴核初始攜帶的噬菌體數(shù)量N0,xj，檢測點(diǎn)噬菌體存活百分比可以通過空氣標(biāo)本中活噬菌體數(shù)量(Nt,xj)除以N0,xj計算。結(jié)果顯示四個檢測點(diǎn)在采樣的第一分鐘內(nèi)損失了40%～80%的噬菌體，各檢測點(diǎn)噬菌體數(shù)量的衰減變化規(guī)律符合對數(shù)衰減特征，與機(jī)械通風(fēng)條件下空氣粒子數(shù)量的衰減特征一致。見圖4。

圖4 空氣標(biāo)本中存活噬菌體的數(shù)量衰減變化

2.5 病房空間噬菌體存活函數(shù) 公式(3)計算獲得的任意檢測點(diǎn)(Xj)液滴核蒸發(fā)前每升空氣中霧化液滴的總體積密度函數(shù)Vt,xj與模擬唾液中噬菌體濃度(C0,個/mL)的乘積就是任意檢測點(diǎn)液滴核初始攜帶的噬菌體數(shù)量(Mt,xj),即：

Mt,xj=Vt,xjC0

(4)

比較通過延伸液滴核噬菌體數(shù)量對數(shù)衰減曲線至t=0處獲得的初始噬菌體數(shù)量和公式(4)的計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在P1檢測點(diǎn)液滴核中約83%的噬菌體在t=0處死亡，說明蒸發(fā)過程中液滴內(nèi)理化指標(biāo)的快速變化對噬菌體存活造成重大影響。P1檢測點(diǎn)空氣樣品中噬菌體數(shù)量隨采樣時間衰減及其對應(yīng)的公式(4)計算結(jié)果見圖5，其中液滴核噬菌體存活數(shù)量以正常對數(shù)表示，兩組數(shù)據(jù)與兩條線性回歸曲線吻合，其最小平方相關(guān)系數(shù)分別為0.90和0.91。

圖5 P1檢測點(diǎn)空氣粒子數(shù)推算噬菌體初始量及空氣標(biāo)本檢測結(jié)果

圖5中兩條線性回歸曲線的的斜率相同，說明檢測點(diǎn)液滴核內(nèi)存活噬菌體數(shù)量的衰減率與由公式(4)計算獲得的液滴核初始攜帶的噬菌體數(shù)量的衰減率一致。在病房內(nèi)任意檢測點(diǎn)Xj空氣中的噬菌體存活函數(shù)可以用暴露時間間隔(t)內(nèi)檢測到的噬菌體數(shù)量(Nt,xj)除以初始噬菌體數(shù)量(Mt,xj)表示，即：

(5)

由于圖5中噬菌體數(shù)量與液滴核數(shù)量呈現(xiàn)等比例減少現(xiàn)象，顯示在采樣時間段內(nèi)利用這兩組數(shù)據(jù)計算獲得的噬菌體存活函數(shù)f(t)變化輕微，說明相對于液滴蒸發(fā)過程而言，蒸發(fā)平衡后液滴核內(nèi)溶質(zhì)可以較好保護(hù)噬菌體在病房空氣中擴(kuò)散較長一段時間，并維持在較低的死亡率。其他三點(diǎn)各點(diǎn)計算結(jié)果檢測數(shù)據(jù)相近，見圖6，顯示病房空氣中噬菌體存活函數(shù)與檢測地點(diǎn)無關(guān)，四個檢測點(diǎn)的噬菌體存活函數(shù)計算結(jié)果與一條線性回歸曲線吻合，其最小平方相關(guān)系數(shù)為0.9，說明檢測時段內(nèi)病房空間任意檢測點(diǎn)的噬菌體存活函數(shù)保持穩(wěn)定，其平均值約為17%。

圖6 四個檢測點(diǎn)噬菌體存活函數(shù)

3 討論

研究呼吸道傳染病的空氣傳播能力，需要研究咳嗽飛沫數(shù)量，飛沫攜帶病原體的能力，飛沫的空氣擴(kuò)散方式，以及飛沫內(nèi)病原體在空氣擴(kuò)散過程中的存活能力。本研究在與唾液具有相似非揮發(fā)性組分的模擬唾液中加入大腸埃希菌噬菌體T1，采用可控方式制造出與咳嗽呼出顆粒物具有類似粒徑分布的液滴譜系，檢測不同粒徑液滴核數(shù)量并估算其初始液滴的幾何尺寸，在已知模擬唾液中大腸埃希菌噬菌體濃度下推算液滴核初始攜帶的大腸埃希菌噬菌體數(shù)量, 而液滴核內(nèi)大腸埃希菌噬菌體的實(shí)際存活量通過采集空氣生物標(biāo)本獲得，比較兩組數(shù)據(jù)即獲得液滴核攜帶的大腸埃希菌噬菌體在病房機(jī)械通風(fēng)條件下的存活函數(shù)，為評估呼吸道傳染病在病房內(nèi)經(jīng)空氣傳播引起感染的風(fēng)險，建立現(xiàn)場試驗(yàn)研究方法。

本研究中使用的模擬唾液，霧化后在空氣中蒸發(fā)作用下霧化液滴的粒徑會變小。蒸發(fā)作用強(qiáng)弱取決于液滴在環(huán)境空氣中處于蒸發(fā)平衡狀態(tài)時表面水汽壓的大小，而蒸發(fā)速率取決于空氣溫度和相對濕度。在極低相對濕度下完全蒸發(fā)的液滴可以達(dá)到結(jié)晶直徑，結(jié)晶直徑的大小取決于液滴中溶解物質(zhì)的數(shù)量[1]。由于模擬唾液與人體唾液的非揮發(fā)性物質(zhì)含量相近，不但為大腸埃希菌噬菌體加入到模擬唾液中后的存活提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于保護(hù)大腸埃希菌噬菌體在霧化過程中免受機(jī)械力的損傷，也使霧化后的液滴與咳嗽產(chǎn)生的飛沫具有相似的空氣蒸發(fā)特征，其幾何學(xué)和空氣動力學(xué)特征也相似[7]。

在與本研究相同試驗(yàn)設(shè)施設(shè)備及霧化點(diǎn)位置條件下，按甘油與蒸餾水1∶3的比例配制霧化液體，對霧化液滴核在病房空氣中的凝結(jié)效應(yīng)的研究[2]結(jié)果表明，液滴核由于相互凝結(jié)作用而導(dǎo)致數(shù)量減少的速率約為1.2×10-3個/s，而與本底粒子相互凝結(jié)而導(dǎo)致數(shù)量減少的速率約為2.26×10-4個/s。凝結(jié)效應(yīng)與重力沉降或機(jī)械通風(fēng)稀釋等因素相比，對于液滴核的去除率相對輕微，相對于本研究中液滴核的數(shù)量，液滴核由于凝結(jié)效應(yīng)造成的數(shù)量減少可以忽略不計。使用數(shù)值計算和示蹤試驗(yàn)技術(shù)對霧化甘油液滴及其液滴核在垂直方向運(yùn)動的研究[2]結(jié)果表明，初始粒徑45 μm以下的霧化甘油液滴在空氣中的懸浮時間超過360 s并表現(xiàn)出空氣傳播特征，由于本研究中霧化液滴與甘油液滴試驗(yàn)中液滴的質(zhì)量濃度相同，在本研究的計算中同樣計入45 μm以下的霧化液滴和液滴核。

霧化液滴及其液滴核的橫向擴(kuò)散由兩個階段構(gòu)成，第一階段擴(kuò)散由噴霧形成的噴射氣流主導(dǎo)，第二階段擴(kuò)散由噴射氣流之外的室內(nèi)空氣運(yùn)動主導(dǎo)。在圖2坐標(biāo)系下，初始粒徑1.5 μm液滴形成的液滴核在第一階段沿X軸方向平均擴(kuò)散1.6 m需要30 s，在相同方向上初始粒徑45 μm液滴形成的液滴核在第一階段擴(kuò)散1 m需要50 s。在Y軸方向第一階段初始粒徑1.5 μm液滴形成的液滴核擴(kuò)散1 m需要80 s，而初始粒徑45 μm液滴形成的液滴核擴(kuò)散0.6 m需要120 s[2]。由此可見液滴核由霧化噴嘴運(yùn)動到檢測點(diǎn)所需時間遠(yuǎn)大于相應(yīng)的蒸發(fā)作用時間，說明本研究中檢測點(diǎn)粒子計數(shù)器記錄的空氣粒子數(shù)減去空氣本底粒子數(shù)后只剩下液滴核的數(shù)量。

現(xiàn)場試驗(yàn)中使用安德森采樣器在檢測點(diǎn)采集空氣生物標(biāo)本，在安德森采樣器內(nèi)培養(yǎng)皿的上層軟瓊脂內(nèi)加入大腸埃希菌用來檢測病房空氣中霧化液滴核中大腸埃希菌噬菌體的存活量。典型大腸埃希菌繁殖過程曲線包含初始1.5 h左右的停滯期、指數(shù)增長期、減速期和衰減期[13]。本研究中使用的含菌肉湯在溫水浴培養(yǎng)8 h后大腸埃希菌濃度達(dá)到5×108CFU/mL，在空氣采樣培養(yǎng)皿的上層軟瓊脂內(nèi)加入0.5 mL含菌肉湯，相當(dāng)于加入了2.5×108CFU大腸埃希菌，而單個大腸埃希菌的面積約為6×10-12m2，培養(yǎng)皿的上層軟瓊脂內(nèi)全部大腸埃希菌約可覆蓋1.5×10-3m2的區(qū)域，鑒于培養(yǎng)皿面積小于6.9×10-3m2及現(xiàn)場空氣采樣一般在培養(yǎng)皿準(zhǔn)備完成后3～4 h后進(jìn)行，現(xiàn)場空氣采樣過程中培養(yǎng)皿的上層軟瓊脂的表面完全能被大腸埃希菌覆蓋。另一方面，現(xiàn)場采樣中空氣采樣器培養(yǎng)皿上層軟瓊脂上采集到的液滴核攜帶的噬菌體數(shù)量較少，在噬菌體數(shù)量少于200 PFU的情況下，每個噬菌體都可以感染一個大腸埃希菌并形成空斑[14]?？諝獠蓸悠髋囵B(yǎng)皿經(jīng)6～8 h培養(yǎng)后出現(xiàn)空斑，空斑直徑約為1～3 mm，但若持續(xù)培養(yǎng)則培養(yǎng)皿上層軟瓊脂內(nèi)的大腸埃希菌會持續(xù)繁殖生長并覆蓋空斑區(qū)域，此將導(dǎo)致低估液滴核內(nèi)噬菌體的存活量，因此應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)需要控制采樣分析節(jié)奏。

現(xiàn)場試驗(yàn)中記錄液滴核數(shù)量的空氣粒子計數(shù)器的粒徑檢測范圍與采集空氣生物標(biāo)本的安德森采樣器采集的空氣粒子粒徑范圍略有不同，其中20～23 μm粒徑范圍的液滴核未被空氣粒子計數(shù)器記錄，可能導(dǎo)致噬菌體存活函數(shù)被高估，不過考慮到此部分粒徑液滴核的總體積小于所有被記錄液滴核的總體積的1%，由此產(chǎn)生的計算誤差可以忽略不計。另一方面，由于安德森采樣器的粒子采集下限原因，粒徑小于0.65 μm的液滴核數(shù)據(jù)也未計算在內(nèi)，從單個大腸埃希菌噬菌體的大小推斷其在粒徑小于0.3 μm液滴核中難以存活，而粒徑范圍在0.3～0.65 μm的液滴核的總體積也小于所有被記錄液滴核的總體積的1%，由此產(chǎn)生的計算誤差也可以忽略不計。在計算中的關(guān)鍵參數(shù)是假定液滴核的粒徑是其初始粒徑的0.4倍，這一假定較為粗糙，不管是模擬唾液的霧化液滴還是咳嗽的唾液飛沫，其實(shí)際蒸發(fā)效應(yīng)都值得進(jìn)一步研究，對于應(yīng)用本研究技術(shù)計算飛沫中病原體的存活函數(shù)至關(guān)重要。

人體咳嗽呼出的氣體量受到個體特征、個體的病理生理學(xué)特征以及咳嗽效率等多種因素影響[15-16]，極端情況下每次咳嗽呼出的氣體量可以達(dá)到0.96～2.6 L[17]，形成飛沫的唾液量約為0.04 mL[11]。為使模擬唾液霧化后不同粒徑段液滴的數(shù)量比例及粒徑分布與Duguid[18]研究的咳嗽所產(chǎn)生飛沫的數(shù)量比例及粒徑分布相近，本研究中模擬唾液的霧化量和噴霧出氣量等參數(shù)使用了相關(guān)研究[7]的結(jié)果?，F(xiàn)場試驗(yàn)中霧化點(diǎn)和檢測點(diǎn)的位置也選擇避免復(fù)雜氣流的干擾，這樣簡化的目的是為了更好了解霧化液滴數(shù)量與空氣生物標(biāo)本之間的關(guān)系，有利于定量分析空氣標(biāo)本中大腸埃希菌噬菌體存活量。

影響霧化液滴及其液滴核所攜帶大腸埃希菌噬菌體存活的主要因素包括噴霧過程的機(jī)械力，干燥過程噬菌體形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及液滴溶質(zhì)濃度變化[19]，以及溫濕度等環(huán)境參數(shù)[20]?，F(xiàn)場試驗(yàn)結(jié)果獲得的噬菌體存活函數(shù)相對穩(wěn)定，與另一研究[4]中在相近溫濕度下大腸埃希菌噬菌體T3在空氣中的存活函數(shù)值相近，說明只需記錄霧化液滴核的數(shù)量就可以推算室內(nèi)空間的生物暴露水平，而不必進(jìn)行繁瑣的空氣生物標(biāo)本采集。由于大量呼吸道傳染病的病原體是病毒，具有與大腸埃希菌噬菌體相似的大小，不會影響咳嗽飛沫的空氣動力學(xué)特征，本研究方法可用于模擬此類呼吸道傳染病通過咳嗽飛沫核攜帶病毒的空氣傳播能力，進(jìn)而評估此類傳染病經(jīng)飛沫核空氣傳播后的感染風(fēng)險，但對于不同的呼吸道傳染病病原體，需要在生物安全前提下研究其在環(huán)境中的存活能力，因?yàn)橛写罅垦芯縖21-22]顯示不同病原體的環(huán)境存活能力不同。

盡管本研究現(xiàn)場試驗(yàn)環(huán)境是典型機(jī)械通風(fēng)條件下的全尺寸病房，但試驗(yàn)過程中病房檢測區(qū)域?qū)嶋H上是空態(tài)?，F(xiàn)實(shí)場景下病房內(nèi)的家具、醫(yī)療設(shè)備、人員、送回風(fēng)口大小、布置位置和風(fēng)速等均會改變室內(nèi)空氣流場[23]，而呼吸道傳染病患者咳嗽的力度、高度、角度、呼出的飛沫量等也是影響飛沫核空氣傳播的重要因素[24]。本研究現(xiàn)場試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了咳嗽呼出飛沫核攜帶病毒在病房內(nèi)的空氣傳播能力，顯示出多病床條件下對其他患者的空氣傳播感染風(fēng)險，而對相鄰病床而言，咳嗽呼出的較大粒徑飛沫形成的飛沫傳播感染風(fēng)險也需高度警惕。通過不同場景下對咳嗽飛沫及其飛沫核攜帶病毒傳播能力的研究，對于制定多床位病房的床間距標(biāo)準(zhǔn)，確定病房內(nèi)物理隔離等防護(hù)方法，評估呼吸道傳染病傳播風(fēng)險都具有參考意義。