HPLC法檢測(cè)晚期糖化產(chǎn)物前體物質(zhì)的柱前衍生化條件優(yōu)化*

楊 陽(yáng) ，嚴(yán) 敏 ，朱美旗 ，高文運(yùn)

（1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安710021;2.西北大學(xué) 國(guó)家微檢測(cè)系統(tǒng)工程研究中心 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710069）

晚期糖基化終產(chǎn)物 (advanced glycation end products，AGEs）是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)（又稱Maillard反應(yīng)），所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱，其結(jié)構(gòu)具有高度異質(zhì)性。

現(xiàn)今研究已證明AGEs是糖尿病并發(fā)癥如糖尿病腎病、糖尿病血管神經(jīng)性病變的重要的機(jī)制之一[1-3]。同時(shí)，還有研究表明AGEs可以和人體的各種組織細(xì)胞相結(jié)合并且破壞這些組織細(xì)胞，加速人體的衰老，從而引起各種慢性退化性的疾病，比如阿爾茨海默病，動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[4-6]。

α-二羰基化合物（ɑ-dicarbonyl compounds，ɑ-DC），是Maillard反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物，也是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的有害物質(zhì)即丙烯酰胺，4（5）-羥甲基糠醛，雜環(huán)胺等的重要前體物質(zhì)。是在體內(nèi)和體外都能產(chǎn)生的化學(xué)和生物活性物質(zhì)?；谑称返馁|(zhì)量控制以及保護(hù)人類健康，建立有效實(shí)用的檢測(cè)手段來(lái)量化各種食品和生物樣品中的α-DCs具有重要意義。

由于α-DCs是一類有著高度水溶而且缺乏發(fā)色團(tuán)的化合物，通過(guò)對(duì)它們進(jìn)行衍生化來(lái)引入一些具有紫外吸收的基團(tuán)，從而來(lái)提高它們的可檢測(cè)性是目前的主要檢測(cè)方法之一。通常使用的衍生化試劑是鄰苯二胺類化合物，原理是鄰苯二胺類化合物可以通過(guò)其鄰二氨基與α-DCs形成喹喔啉化合物[7]，進(jìn)而產(chǎn)生紫外吸收。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)使用4-硝基鄰苯二胺（NPDA）作為衍生化試劑的文獻(xiàn)報(bào)道少，且各文獻(xiàn)報(bào)道用NPDA柱前衍生測(cè)定α-DCs含量的衍生條件不一致[8-10]，并且不同衍生條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響未見(jiàn)報(bào)道。故本研究對(duì)HPLC法檢測(cè)AGEs前體物質(zhì)（乙二醛、甲基乙二醛、2，3-丁二酮、2，3-戊二酮）的柱前衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，可為后續(xù)食品或生物樣品中α-DCs的測(cè)定打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SQP電子分析天平（賽多利斯科技儀器（北京）有限公司）；DG-800旋渦混合器（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；BDWI-HH-2A電熱恒溫水浴鍋（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；8453（紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Agilent公司）；Agilent LC1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司）；4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA阿拉丁上海精純?cè)噭┯邢薰荆?；乙二醛水溶液?.8M阿拉丁上海精純?cè)噭┯邢薰荆?；甲基乙二醛?2%溶液阿拉丁上海精純?cè)噭┯邢薰荆?，3-丁二酮（99%阿法愛(ài)莎醫(yī)藥有限公司）；2，3-戊二酮（97%西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；濃鹽酸（AR上海生物工程技術(shù)有限公司）；氫氧化鈉（AR四川西隴化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 α-二羰基類化合物的衍生化反應(yīng)

將50mM的2，3-戊二酮、甲基乙二醛、2，3-丁二酮、乙二醛水溶液用超純水分別逐級(jí)稀釋至濃度為500μM，將10mM的NPDA醇溶液用甲醇逐級(jí)稀釋至濃度為500μM，然后將α-DCs標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取100μL與100μL NPDA分別渦旋混勻，再加入800μL的甲醇稀釋至α-DCs標(biāo)準(zhǔn)品溶液終濃度為50μM，用pH值為1～14的B-廣泛試紙調(diào)pH值至3，用電熱恒溫水浴鍋在適宜的溫度下加熱一定的時(shí)間，取出放置至室溫，4℃保存待檢。

2.2 紫外最大吸收波長(zhǎng)的確定

因α-DCs無(wú)紫外吸收，因此，需檢測(cè)衍生化反應(yīng)前后紫外吸收波長(zhǎng)的變化，所以首先單獨(dú)取500μM NPDA 200μL 裝入石英比色皿中，在 200～800nm波長(zhǎng)范圍掃描，測(cè)得有兩個(gè)最大的吸收波長(zhǎng)，分別是λ1=272.0nm，λ2=401.0nm。然后分別取衍生化后的α-DCs標(biāo)準(zhǔn)品溶液200μL置于石英比色皿中，在200～800nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 α二羰基類化合物衍生化產(chǎn)物紫外-可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)Tab.1 Ultraviolet-visible absorption wavelength of derivatives of dicarbonyl compounds

由表1可見(jiàn)，測(cè)得的結(jié)果基本接近于260.0nm，且260.0nm處的峰容易辨別，故采用260.0nm作為最大吸收波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件的選擇和色譜峰的檢測(cè)

色譜柱Shim Pack VP-ODS C18column（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇∶水 =65∶35，等度洗脫；流速 0.7mL·min-1；柱溫 35℃；進(jìn)樣量 10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。4種α-DCs的色譜峰見(jiàn)圖1。

圖1 柱前衍生化后4種α二羰基類化合物的液相色譜圖Fig.1 Pre-column derivatization HPLC chromatogram of 4 α-dicarbonyl compounds 1.NPDA 2.methylglyoxal 3.glyoxal 4.2,3-butanedione 5.2,3-pentanedione

2.4 單因素試驗(yàn)-衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 pH值對(duì)衍生化反應(yīng)進(jìn)程的影響 取1mM的NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1（終濃度為100μM）平行配制12份樣品，分為4組，每組設(shè)3個(gè)平行。4組的pH值分別調(diào)至3、5、7、9，在同一溫度下加熱一定時(shí)間，過(guò) 0.22μm濾膜，按2.3方法測(cè)定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)α二羰基類化合物衍生化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of pH on the derivatization of α-dicarbonyl compounds

由圖2可見(jiàn)，甲基乙二醛和戊二酮在pH值為3時(shí)的峰面積最大，為反應(yīng)最適pH值條件。丁二酮在pH值為5時(shí)的峰面積略大于其余3個(gè)pH值條件下的峰面積，衍生化反應(yīng)受pH值為值影響較小。乙二醛的峰面積則在pH值為9時(shí)最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，除乙二醛外，其余3個(gè)α-DCs的最適反應(yīng)條件為酸性，而乙二醛的衍生化反應(yīng)則隨著pH值的升高而增強(qiáng)，最適反應(yīng)條件為堿性。

2.4.2 溫度對(duì)衍生化反應(yīng)進(jìn)程的影響 取1mM的NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1(終濃度為100μM)平行配制12份樣品，分為4組，每組設(shè)3個(gè)平行。將樣品的pH值均調(diào)至 3，4 組樣品分別在溫度為 25、40、60、80℃時(shí)加熱一定時(shí)間，過(guò)0.22μm濾膜，按2.3方法測(cè)定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，2，3-丁二酮和戊二酮的衍生化反應(yīng)對(duì)溫度不敏感，40℃為最適反應(yīng)溫度。乙二醛在40℃時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積最大，之后隨著溫度升高，峰面積下降，初步判斷是由于溫度過(guò)高而產(chǎn)物發(fā)生了分解所致。因此，乙二醛衍生化的最適反應(yīng)溫度也為40℃。而甲基乙二醛的最適反應(yīng)溫度為60℃。

圖3 溫度對(duì)α二羰基類化合物衍生化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of temperature on derivatization of α-dicarbonyl compounds

2.4.3 加熱時(shí)間對(duì)衍生化反應(yīng)進(jìn)程的影響 取1mM的 NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1（終濃度為100μM）平行配制15份樣品，分為5組，每組設(shè)3個(gè)平行。將樣品的pH值均調(diào)至 3，5 組樣品分別于 40℃加熱 10、20、30、60、120min，過(guò)0.22μm濾膜，按2.3方法測(cè)定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)α二羰基類化合物衍生化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of heating time on the derivatization of α-dicarbonylcompounds

由圖4可見(jiàn)，丁二酮和乙二醛的峰面積隨加熱時(shí)間變化的趨勢(shì)一致，最適反應(yīng)溫度均為30℃。戊二酮與甲基乙二醛的最適反應(yīng)溫度均為20℃。戊二酮的色譜圖中，當(dāng)加熱時(shí)間達(dá)到或超過(guò)60min，在TR=10min附近出現(xiàn)雜峰，說(shuō)明高溫會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物分解或發(fā)生其他副反應(yīng)。

2.4.4 物質(zhì)的量的比例對(duì)衍生化反應(yīng)進(jìn)程的影響 分別按照體積比 1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1 的比例取200μM的NPDA和200μM的2，3-戊二酮，混勻。每個(gè)比例平行配置3份，共15份。調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，過(guò)0.22μm濾膜。按2.3方法測(cè)定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 物質(zhì)的量的比例對(duì)α二羰基類化合物衍生化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of the ratio of the amount of substance on the derivatization of α-dicarbonyl compounds

由圖5可見(jiàn)，戊二酮和2，3-丁二酮在物質(zhì)的量1∶1時(shí)，峰面積最大，此后隨著NPDA量的增加，峰面積逐漸下降。說(shuō)明二者最適的反應(yīng)物質(zhì)的量比例為1∶1。甲基乙二醛和乙二醛最適的反應(yīng)物質(zhì)的量比例分別為 8∶1 和 10∶1。

2.5 優(yōu)化后標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用甲醇和超純水分別將NPDA和2，3-戊二酮儲(chǔ)備液稀釋為 2、1、0.5、0.25、0.125mM的溶液，各吸取相同濃度的二者200μL，混勻。制成2，3-戊二酮終濃度分別為 1000、500、250、125、62.5μM 的系列濃度溶液。調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，按2.3方法測(cè)定。以2，3-戊二酮衍生物的峰面積A對(duì)2，3-戊二酮摩爾濃度C進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮類似。各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：2，3-戊二酮y=4.7749x+74.017，R2=0.9993，在 62.5～1000μM 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；甲基乙二醛y=82.987x-542.14，R2=0.9995，在 5.5～220μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；2，3-丁二酮y=9.1958x+58.938，R2=0.9981，在 5～1000μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；乙二醛y=10.967x-75.27，R2=0.9979，在5～120μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取濃度為 500μM的 NPDA 400μL，500μM的 2，3- 戊二酮 400μL（物質(zhì)的量的比例 1∶1）置于同一4.0mL的EP管中，用旋渦混合器混勻，調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，其余化合物均在最適反應(yīng)條件下配置和反應(yīng)。在2.3的色譜條件下，分別測(cè)產(chǎn)物 0，12，24，48h 內(nèi)的峰面積，2，3- 戊二酮，甲基乙二醛，2，3-丁二酮，乙二醛衍生物峰面積的RSD值分別為4.82%，2.12%，4.88%，2.08%，結(jié)果表明衍生化后供試溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

鄰苯二胺（o-Phenylenediamine，OPDA）及其類似物能夠與α-DCs反應(yīng)形成喹喔啉衍生物，從而使原本缺乏紫外吸收的α-DCs產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收，可用作柱前衍生-HPLC方法測(cè)定α-DCs的衍生化試劑。其中NPDA苯環(huán)上的硝基令它比一些簡(jiǎn)單的鄰苯二胺類化合物，如OPDA在紫外及可見(jiàn)光波段的吸收都更強(qiáng)。且該試劑穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉，易于獲得。而各文獻(xiàn)報(bào)道用NPDA柱前衍生測(cè)定α-DCs含量的衍生條件不一致，并且不同衍生條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)單因素考察pH值，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，物質(zhì)的量比例對(duì)α-DCs衍生化反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，本文中4個(gè)α-DCs的衍生化反應(yīng)條件除乙二醛外均為酸性，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙二醛在酸性條件下的反應(yīng)需提高溫度到70～80℃，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)影響α-DCs前體物質(zhì)的自氧化，且在衍生化試劑的存在下會(huì)改變葡萄糖的自氧化途徑，這些都會(huì)導(dǎo)致α-DCs的含量測(cè)定并不準(zhǔn)確。而在堿性條件下乙二醛的反應(yīng)溫度溫和。另外，在四個(gè)α-DCs中，甲基乙二醛對(duì)于反應(yīng)條件的變化最為敏感。

4 結(jié)論

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，NPDA可在溫和的反應(yīng)條件下，短時(shí)間內(nèi)與α-DCs發(fā)生衍生化反應(yīng)。甲基乙二醛，2，3-丁二酮，2，3-戊二酮的反應(yīng)最適pH值為酸性，乙二醛的最適pH值為堿性。加熱溫度不宜過(guò)高，加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則衍生化產(chǎn)物可能會(huì)發(fā)生分解?？蔀楹罄m(xù)食品或生物樣品中α-DCs的測(cè)定打下基礎(chǔ)。