知母多糖提取中的美拉德反應(yīng)及影響因素*

雷 霞，張文森，薛 慧，張 寧，肖洪彬

（黑龍江省中藥健康保健產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

中藥知母為百合科植物（Anemarrhena asphodeloides Bge.）知母的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)。功效清熱瀉火，滋陰潤燥[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)水提醇沉法制備的知母粗多糖具有潤腸通便功能，特別是鹽制知母多糖出膏率明顯增加，通便功能更強[2]。從知母中提取得到了較高純度的多糖組分，并且分離得出4種知母均一多糖，分子量分別為147萬、161萬、216萬、276萬和530萬，單糖組成為：鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖或鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖。在濃縮知母水煎液時，我們發(fā)現(xiàn)濃縮液顏色明顯加深，并產(chǎn)生濃烈的芳香氣味[3]。因知母中含有多種氨基酸，如色氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等[4]；知母還含有多種還原糖[5]，由于還原糖和氨基酸是美拉德反應(yīng)的底物，我們推測在這個過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)[6]。美拉德（Maillaed）反應(yīng)是在1912年由美拉德在進行試驗的過程中，發(fā)現(xiàn)甘氨酸與葡萄糖混合共熱時二者均發(fā)生了反應(yīng)，故稱為美拉德反應(yīng)。其中間生成物5-HMF（5-羥甲基糠醛）的積累與美拉德反應(yīng)速度密切相關(guān)，因此，可以將實驗過程中5-HMF的含量變化作為預(yù)測美拉德反應(yīng)速度的重要指標之一[8]。本文利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 對知母在濃縮過程中其揮發(fā)性反應(yīng)產(chǎn)物進行分析，同時利用高效液相色譜法對5-HMF進行檢測，結(jié)合氨基酸種類和還原糖含量的變化，探討美拉德反應(yīng)及其影響因素。

1 材料

1.1 儀器

KQ5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；7890A－5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent）。

1.2 試劑

葡萄糖（天津市凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品）；H2SO4（沈陽市華東試劑廠）；苯酚（天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心）；冰乙酸（天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司）；無水乙酸鈉（天津市大茂化學試劑廠）；水合茚三酮（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；L-白氨酸（M-中國惠世生化試劑有限公司）；乙醇（95%）（天津市凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品）；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

1.3 藥材

知母生藥材由世一堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院中藥鑒定教研室陳效忠教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。

2 方法

2.1 知母水煎液的濃縮

取知母藥材飲片1kg，加8倍量水浸泡60min，水煎煮提取3次，每次40min，8層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮。取 30、60、90、120、150、180min 濃縮液樣品分別裝入試管，密度計測密度，加塞后分別置于60、70、80和 90℃的恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫加熱30～150min，反應(yīng)結(jié)束后冰水水浴進行冷卻。待檢液在4℃，13000r·min-1，10min 的條件下離心，各取上清液保存待檢。

2.2 游離氨基酸含量測定

根據(jù)黃松[11]用茚三酮比色法測量青天葵中氨基酸含量的方法，測量知母中氨基酸含量。分別以游離氨基酸含量做橫坐標，570nm處吸光值做縱坐標，繪制標準曲線：y=0289x+0.3618。

2.3 總糖含量測定

同 2.1。4℃離心，4000r·min-1，15min；再用 50mL蒸餾水洗一次，離心，兩次上清液合并，定容至100mL。

標準曲線的繪制取5mL具塞試管，分別配制梯度濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的葡萄糖對照品標準液1mL。加入苯酚硫酸液2mL，混合，煮沸10min，冷卻后定容至50mL，在540nm波長下測定吸光度值。以吸光度為縱坐標，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

另取5mL具塞刻度試管，分別加入上述提取得到的樣品還原糖待測液1mL，加入顯色劑2mL，按上述方法進行實驗。測定各樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算出相應(yīng)的葡萄糖含量，計算樣品中還原糖的質(zhì)量百分含量（以葡萄糖計）。

2.4 5-HMF含量測定

將待檢液用去離子水進行定容至5mL進行HPLC檢測，進樣前先用0.45μm微孔濾膜進行過濾。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（體積比為5∶95）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：285nm；進樣量 5μL。

2.5 GC-MS分析香氣成分

取待測液用無水Na2SO4進行處理。

氣相色譜條件：色譜柱為石英毛細管柱DB-17（60m×250μm×0.25μm）；進樣口溫度 250℃；載氣流量：1.2mL·min-1，分流比：30∶1，進樣量：1μL（正己烷液）。升溫程序：初始柱溫45℃，以4℃·min-1升到140℃，再以5℃·min-1升到220℃保持2min，再以25℃·min-1升到 320℃，保持 5min。質(zhì)譜條件：電離方式 EI，電子轟擊能量：70eV，離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150℃，溶劑延遲：6min，掃描范圍：全掃描，碰撞氣體：高純 He（99.999%）。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同時間、溫度、濃度下知母濃縮液糖、氨基酸含量

葡萄糖標準曲線以吸光度A對葡萄糖質(zhì)量X做線性回歸，得到回歸方程：y=10.263x+0.0093，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，線性良好。

精密度實驗 取同一葡萄糖標準液連續(xù)測定10次，其吸光度平均值為0.483，相對標準偏差RSD為0.21%，說明儀器精確度良好。

表1 不同提取條件對知母氨基酸、還原糖含量變化的影響Tab.1 Effects of free amino acid and glucose content treated by different conditions in AA

重復(fù)性實驗 取同一批樣品3份，進行重復(fù)實驗，結(jié)果RSD為0.63%，表明該實驗的重復(fù)性良好。

知母水提物在濃縮過程中，隨著濃度加大，氨基酸總質(zhì)量分數(shù)顯著降低。隨著時間延長，氨基酸總質(zhì)量分數(shù)顯著降低，60～90min時下降最快。隨著溫度升高，氨基酸總質(zhì)量分數(shù)顯著降低。溫度為60℃，時間為150min開始出現(xiàn)顯著降低。

表2 氨基酸含量主體間效應(yīng)的檢驗Tab.2 Test of Intersubjective effect of amino acid content

表3 葡萄糖含量主體間效應(yīng)的檢驗Tab.3 Testing of intersubjective effects of glucose content

3.2 不同提取條件下5-HMF含量

選擇0.2和0.5g·mL-1兩個濃度，在不同溫度下對產(chǎn)物5-HMF進行定量分析。知母因提取溫度升高，平均動能越大，分子熱運動的程度越劇烈。結(jié)果顯示，5-HMF含量隨提取溫度升高逐漸降低，在60、70℃時含量顯著高于80℃，說明60℃就已經(jīng)發(fā)生美拉德反應(yīng)，程度較劇烈，反而過高的溫度下未檢測到大量的5-HMF。

3.3 香味成分的鑒定

GC-MS檢測到揮發(fā)性物質(zhì)12種，鑒定出的化合物有：4-溴-2,5-二甲氧基苯丙胺、3-糠醛、糠醛、DL-丙氨酰-DL-纈氨酸、苯丙胺、2-氨基-6甲基庚烷、檸檬烯、2,5-二甲氧基-4-（甲磺酰）苯基、丙酮胺、丙酰胺、2-氯-4-喹啉甲酸、2-丙烯醛。

圖2 知母濃縮液中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in anemarrhena concentrate

以下是對知母這些化合物進行的成分鑒定，根據(jù)面積歸一化法比較其相對含量。

表3 知母濃縮液中揮發(fā)性成分的鑒定Tab.3 Identification of volatile components in Anemarrhena concentrate

4 討論

1912年法國著名食品化學家Louis-Camille Maillard首次將甘氨酸和葡萄糖混合共熱時發(fā)現(xiàn)混合液有氣味香甜，因此，被命名為美拉德反應(yīng)[9]。該反應(yīng)在食品化學工藝上有非常重要的價值，但在中藥加工炮制中的研究較少。然而許多中藥都含有氨基酸和糖類，這些是美拉德反應(yīng)必不可少的反應(yīng)底物。而且在提取、濃縮、炮制過程伴隨著氣味和顏色改變，產(chǎn)生特殊的香味和顏色，某些已經(jīng)被證實屬于美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)新生產(chǎn)物改變了中藥的口感和成分，特別是生成具有抗氧化作用的物質(zhì)，甚或是有毒物質(zhì)[10]。

本課題通過采用L9（34）正交實驗設(shè)計考察濃度、時間、溫度對濃縮過程的影響，發(fā)現(xiàn)知母在濃縮過程中還原糖含量、氨基酸含量顯著受濃度和煎煮時間的影響，在0.2g·mL-1濃度，40min時糖和氨基酸顯著下降，0.5g·mL-1和90min時糖和氨基酸含量降至最低。知母水提物濃縮過程中濃度增加，配合合適的溫度，糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生了美拉德化學反應(yīng)。這種反應(yīng)的存在會引起藥物原有成分遭到破壞，療效降低，而且新生產(chǎn)物可能產(chǎn)生其他未知的功效或副作用。

我們接下來采用UPLC-MS法考察美拉德反應(yīng)相對劇烈的兩個濃度下改變溫度時產(chǎn)物變化，檢測到在不同條件下濃縮液中5-HMF的含量有所不同。5-羥甲基糠醛、晚期糖基化終產(chǎn)物、丙烯酰胺等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有微毒，這些化合物被證明可能與許多慢性退行性疾病存在關(guān)系，如白內(nèi)障、阿爾茨海默病、糖尿病、尿毒癥以及人體的衰老等。甘味藥在臨床常用中藥中所占的比例較高，且以糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等化合物含量相對較高，在合適的溫度和濃度下加工就會產(chǎn)生5-HMF。

最后，本文對知母濃縮過程中美拉德反應(yīng)最為劇烈的條件（0.3g·mL-1、70℃、60min)下得到濃縮液采用GC-MC分析，檢測出22種化學成分，18個匹配度在90%以上的化合物被鑒定。這些已鑒定的化合物中，峰面積之和占總峰面積的96.218%。主要成分為亞油酸（3%）、棕櫚酸（25.1%）、丁香酚（5.7%）、已醛（15.9%）、乙酸異戊酯（15.0%）等，其余成分相對含量較低，其余占總含量超過百分之一的成分有硬脂酸，油酸、龍腦、正戊基呋喃、二十七烷和二十九烷等[3]。棕櫚酸、亞油酸、油酸等脂肪酸類成分，具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集及血栓形成等作用。而乙酸異戊酯用作溶劑配制多種香精，用于食品、保潔用品等多種行業(yè)，有一定的呼吸道刺激，低毒。已醛用作增塑劑，以及橡膠、樹脂、殺蟲劑的有機合成，無論吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收后都會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。

綜上所述，知母在前煮過程中應(yīng)當按照藥材吸水率加水，加水量過多時在正常時間內(nèi)無法達到預(yù)期濃度，濃縮過程過長便會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)。這也提示我們，藥品生產(chǎn)制造中，中藥提取濃縮的環(huán)節(jié)是非常重要和需要規(guī)范的，分析和研究中藥提取濃縮過程對于提高我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的科技水平、生產(chǎn)效率和節(jié)約資源等都具有重要意義。這需要引起臨床藥師、臨床中醫(yī)師和家庭自行煎藥患者的足夠重視。

5 結(jié)論

課題組前期對知母多糖的提取工藝進行優(yōu)化和設(shè)計，擬得到純度高、活性好的多糖組分。本研究結(jié)果表明，知母長時間的濃縮過程中存在美拉德反應(yīng)，60～70℃反應(yīng)最劇烈，低濃度下反應(yīng)溫和，濃度越高越劇烈。所以，單純增加溶劑提高多糖提取效率是需要慎重考慮的，濃縮過程更應(yīng)注意溫度和濃度的交互作用關(guān)系。