EP管法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

楊小平，曾慧君，虞偉明，陳瓊，酈娟，楊永

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢430012）

0 引言

葉酸是指葉酸和具有葉酸生物活性的一類(lèi)物質(zhì)的總稱[1]，攝入不足易引發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血和胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷[2]，人體自身無(wú)法合成葉酸，只能通過(guò)飲食攝入，因此保證足夠的葉酸攝入量非常重要，特別是對(duì)于嬰幼兒而言。

檢測(cè)食品中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法[3]，HPLC法[4]和微生物法[5]。色譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由于奶粉基質(zhì)及成分復(fù)雜等因素，靈敏度和回收率均比微生物法低[6]，因此國(guó)際仲裁方法為微生物法。本研究在微生物法原理的基礎(chǔ)上，用2 mL的EP管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的試管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣品溶液的培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化措施，極大降低了檢驗(yàn)工作量，命名為EP管法，更適用于日常批量檢驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌，CICC 6224；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，BD，美國(guó)；葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，青島海博；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，BD，美國(guó)；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度97.0%，SUPELCO，美國(guó)；瓷珠菌種保存管，青島海博；一次性無(wú)菌過(guò)濾器，0.45μm，密理博。

嬰幼兒配方乳粉，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，貨號(hào)QC-IP-016，特性值為142.0μg/100g，能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差23.4μg/100g，量值范圍為95.2～188.8μg/100g。

超純水機(jī)，密理博；imark多功能酶標(biāo)儀，BIORAD公司；全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)，美國(guó)Biomerieux公司；UV2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)量控制措施

測(cè)定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須有足夠的質(zhì)量控制措施，包括：玻璃器皿，培養(yǎng)基，菌株，葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，葉酸質(zhì)控樣品及加標(biāo)試驗(yàn)。

玻璃器皿先用自來(lái)水洗刷干凈，沸水煮30 min，再在1∶50的稀鹽酸中浸泡24 h以上，二級(jí)水沖洗干凈，200℃烘2 h待用；葉酸測(cè)定培養(yǎng)基的驗(yàn)證，參照GB 5009.211-2014設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗(yàn)證培養(yǎng)基對(duì)各梯度濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)程度，以未接種0對(duì)照管作空白對(duì)照，測(cè)定接種的標(biāo)準(zhǔn)0管的吸光度值，若吸光度值在0.1以下，說(shuō)明培養(yǎng)基中葉酸本底符合要求，同時(shí)驗(yàn)證測(cè)定培養(yǎng)基、工作菌株和標(biāo)準(zhǔn)溶液三者之間配合響應(yīng)程度；菌株的驗(yàn)證。觀察菌株在平板上的顏色、形態(tài)、大小、劃線的觸感，并使用厭氧菌和棒狀桿菌鑒定卡在全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行生化特征驗(yàn)證；關(guān)于葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品可能會(huì)含水，所以需要用分光光度計(jì)進(jìn)行標(biāo)定，經(jīng)稀釋后配制成葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，分裝至2 mL的EP管，-20℃保存；葉酸質(zhì)控樣品及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)需要用葉酸質(zhì)控樣品進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，計(jì)算回收率，驗(yàn)證測(cè)試體系的有效性。

1.2.2 工作菌株的制備

取鼠李糖乳桿菌凍干管，復(fù)蘇菌株，按照瓷珠菌種保存管的方法，-20℃保存作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。需要時(shí)，取一顆瓷珠到乳酸桿菌瓊脂平板上，充分接觸接種，傳三代左右，按照國(guó)標(biāo)的方法制備接種菌液，將此菌液與60%甘油按一定的比例混合，分裝于2 mL的EP管中-20℃保存，此凍存液可作為下次實(shí)驗(yàn)的工作菌液。

1.2.3 樣品的制備及稀釋

根據(jù)奶粉標(biāo)簽值稱取0.3～0.5 g奶粉，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解并超聲使其完全溶解分散，定容至100 mL，再用水做適當(dāng)稀釋，使樣液中葉酸質(zhì)量濃度在0.2～0.5 ng/mL，用注射器吸取樣液0.45μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾出約1 mL樣液備用。

1.2.4 樣品測(cè)定管的制備

將2 mL EP管插入雙面板中，分別吸取樣液0.05，0.1，0.2 mL至3個(gè)EP管中，補(bǔ)水至0.5 mL，再加入0.5 mL含菌液的測(cè)定培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品測(cè)定管的制備體積 mL

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按表2的順序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸的量分別為0.000，0.005，0.010，0.020，0.030，0.040，0.050，0.060，0.080，0.100 ng。另3支EP管設(shè)置為0對(duì)照管，設(shè)置同S1但不加菌液。如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備體積 mL

1.2.6 培養(yǎng)

將上述制備好的樣品管和標(biāo)準(zhǔn)曲線管放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)40～44 h，直至葉酸消耗完。

1.2.7 測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，混勻培養(yǎng)液，各取0.2 mL培養(yǎng)液到本底均一的空白酶標(biāo)板中，靜置1 h后在630 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值，保存數(shù)據(jù)。

1.2.8 結(jié)果計(jì)算

應(yīng)用拜發(fā)試劑盒的計(jì)算軟件，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的質(zhì)量濃度和數(shù)量，根據(jù)每個(gè)孔的吸光度值計(jì)算出每個(gè)樣品孔內(nèi)葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和稱樣量計(jì)算出樣品中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 各質(zhì)量控制因素的影響

基于微生物法原理測(cè)定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，質(zhì)量控制措施非常必要。試驗(yàn)中用到的玻璃器皿要注意有機(jī)物的污染，清洗完成后，高溫烘烤可去除有機(jī)物殘留，避免有機(jī)物或抗生素等對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響[7-8]。

選擇合適的測(cè)定培養(yǎng)基是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。2017年以前多使用BD葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，2017年以后，葉酸酪蛋白培養(yǎng)基停產(chǎn)，大部分實(shí)驗(yàn)室使用青島海博或北京陸橋的葉酸測(cè)定培養(yǎng)基。葉酸測(cè)定培養(yǎng)基的關(guān)鍵是酪蛋白，酪蛋白中若未去除殘留的葉酸，則在測(cè)定中本底偏高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性也較差，不適合做葉酸的定量檢測(cè)[9]。

微生物法測(cè)定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的菌株有3種：鼠李糖乳桿菌，糞鏈球菌和啤酒小球菌。每種菌株對(duì)不同結(jié)構(gòu)的葉酸敏感程度不同，糞鏈球菌只對(duì)非甲基化葉酸敏感；鼠李糖乳桿菌則對(duì)單谷氨酸葉酸、含2或3個(gè)谷氨酸的葉酸及其還原型衍生物均敏感，是3種菌株中反應(yīng)譜帶最寬的一種，也是最為常用的菌種[5]。為保證在運(yùn)輸、傳代、儲(chǔ)存過(guò)程中菌株性能的穩(wěn)定性，使用前需要對(duì)菌株的關(guān)鍵生化指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)工作菌株是否適用。

加標(biāo)實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)培養(yǎng)體系中是否有抑制劑存在，低回收率說(shuō)明抑制劑存在。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品，S O’Broin等人使用鼠李糖乳桿菌測(cè)定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，無(wú)論采用葉酸，5-甲基-四氫葉酸或5-甲酰-四氫葉酸，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本相同，說(shuō)明這幾種常見(jiàn)形式的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果幾乎無(wú)影響[10]。

2.2 工作菌液制備方式的優(yōu)化

菌株的傳代次數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定，以菌株活力能滿足實(shí)驗(yàn)要求為宜。關(guān)于最終測(cè)定體系中的接種量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌液的透光率在80%左右，菌液與培養(yǎng)基的體積比為1：200為宜。菌量太大，則吸光度值的波動(dòng)較大。將工作菌株冷凍保存在由等量60%甘油和葉酸測(cè)定培養(yǎng)基組成的冷凍保護(hù)液中，能有效防止冰晶對(duì)菌體的損害。將解凍后的工作菌液按比例加入到測(cè)定培養(yǎng)基中進(jìn)行混合，培養(yǎng)體系均勻性更好，有利于保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

2.3 測(cè)定體系的優(yōu)化

與國(guó)標(biāo)法相比，本方法將測(cè)定體系等比例10倍縮小為1 mL，但體系中葉酸的質(zhì)量濃度不變。優(yōu)化后，使用EP管代替試管，EP管架代替試管架，移液器代替各種移液管。樣液及葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液均采用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌，消除了高溫高壓滅菌對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。過(guò)濾除菌的樣液及標(biāo)準(zhǔn)工作液均可-20℃短期存放，方便了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的復(fù)測(cè)。

2.4 測(cè)定方式的優(yōu)化

紫外分光光度計(jì)測(cè)量每根試管的吸光度值耗時(shí)耗力，測(cè)量時(shí)間的間隔不一致，測(cè)定條件不統(tǒng)一。EP管法培養(yǎng)結(jié)束后將菌液混合均勻，吸取培養(yǎng)液到空白酶標(biāo)板中測(cè)定吸光度值，可大大縮減讀數(shù)時(shí)間，且各管測(cè)定時(shí)間間隔一致，保證了測(cè)量結(jié)果的可靠性。

2.5 結(jié)果的計(jì)算

拜發(fā)微孔板法葉酸測(cè)定試劑盒采用微生物法原理測(cè)定樣品中添加及原生的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其自帶的計(jì)算軟件默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線為四項(xiàng)式，該軟件可以個(gè)性化設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量和質(zhì)量濃度，通過(guò)設(shè)置樣品孔的數(shù)量及布局，可自動(dòng)計(jì)算各樣品孔中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再通過(guò)稱樣量和稀釋倍數(shù)即可計(jì)算樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。相比傳統(tǒng)的手繪標(biāo)準(zhǔn)曲線更省時(shí)省力，計(jì)算各管中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)更加準(zhǔn)確方便。

2.6 EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其R2可達(dá)0.99以上，表明相關(guān)性良好。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置，可以參考GB 5009.211-2014，也可以根據(jù)樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加或減少標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)量的設(shè)置，擴(kuò)大或縮小標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。

微生物法不同于一般的化學(xué)方法，只有在葉酸達(dá)到一定量后，才能刺激鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)并得到線性的生長(zhǎng)響應(yīng)，所以檢出限的確定主要考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低響應(yīng)值。在本方法中，葉酸的量大于0.005 ng可以被穩(wěn)定檢出，但當(dāng)樣品中葉酸的量低于0.005 ng時(shí)無(wú)法外推預(yù)估，因此僅能以最低標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算；葉酸的量在0.01～0.08 ng之間時(shí)能保證3個(gè)樣品管的葉酸質(zhì)量濃度有兩個(gè)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；本方法主要針對(duì)嬰幼兒配方乳粉，其添加的葉酸為強(qiáng)化葉酸，不需要考慮原生葉酸及酶源酶空白葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以奶粉稱樣量0.5 g計(jì)算，檢出限和定量限分別為

圖1 EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 加標(biāo)回收率

配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以葉酸質(zhì)控樣品作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別稱取4次0.3 g的試驗(yàn)樣品，各加入0,0.5,1.0,2.0 mL上述葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，則所加入的葉酸的量分別為0，50，100，200 ng；將實(shí)驗(yàn)樣品和葉酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋定容至100 mL，按EP管法步驟進(jìn)行3次測(cè)試，結(jié)果如表3所示。加標(biāo)回收率=（加標(biāo)樣品測(cè)定量-樣品本底測(cè)定量）/加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量×100%，其范圍為98.0%～107.5%,根據(jù)GB/T 27404-2008的要求，EP管法加標(biāo)回收率符合要求。

表3 EP管法加標(biāo)回收率實(shí)試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)質(zhì)控樣品和3種不同品牌的市售奶粉進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做6次平行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，分別計(jì)算各樣品的RSD值，葉酸質(zhì)控樣品的RSD值為4.7%，3個(gè)市售奶粉的RSD值在7.8%～9.2%之間，說(shuō)明本方法的重復(fù)性良好。

表4 EP管法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 μg/100g

2.9 不同稀釋倍數(shù)對(duì)測(cè)量值的影響

稱取質(zhì)控樣品，采取四個(gè)不同的稀釋倍數(shù)，每個(gè)稀釋倍數(shù)做兩組平行進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。分析不同稀釋倍數(shù)下的檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)范圍，結(jié)果表明在不同的稀釋倍數(shù)下，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定，測(cè)量值均在可接受的范圍內(nèi)。

2.10 EP管法和國(guó)標(biāo)法的比較

稱取質(zhì)控樣品和3種市售奶粉，國(guó)標(biāo)法按照GB5009.211-2014進(jìn)行檢測(cè)，按照2.7的要求設(shè)置加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算回收率，檢測(cè)結(jié)果如表6所示。

表5 不同稀釋倍數(shù)下QC-IP-016葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) μg/100g

表6 EP管法和國(guó)標(biāo)試管法檢測(cè)結(jié)果 μg/100g

2.11 試劑的穩(wěn)定性

將含甘油的工作菌液，葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品過(guò)濾液分裝于EP管中，-20℃保存，第一個(gè)月每?jī)芍軠y(cè)量一次，以后每個(gè)月測(cè)量1次，連續(xù)6個(gè)月，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7,試驗(yàn)結(jié)果表明-20℃保存條件下關(guān)鍵試劑的穩(wěn)定性良好。試劑的穩(wěn)定性提示我們，工作菌液、標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品稀釋液可以一次配制，分裝冷凍保存，按需取用，這將大大縮減試驗(yàn)時(shí)間。

表7 QC-IP-016試劑穩(wěn)定性評(píng)估實(shí)試驗(yàn) μg/100g

3 結(jié)論

EP管法，試管法和微孔板法都采用微生物法的原理測(cè)定葉酸，但這3種方法又具有各自的特點(diǎn)。試管法的方法設(shè)置嚴(yán)謹(jǐn)，思路清晰，但準(zhǔn)備工作較繁瑣，工作量大，難以應(yīng)對(duì)大批量的樣品檢驗(yàn)；微孔板法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用較成熟，但對(duì)于大批量樣品檢驗(yàn)成本較高；而EP管法則融合了試管法和微孔板法的優(yōu)點(diǎn)，用EP管代替試管進(jìn)行培養(yǎng)，縮小了培養(yǎng)體積，采用凍存的工作菌株，可以縮短實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備時(shí)間，整體極大的提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性，有效縮短了檢驗(yàn)周期，能適應(yīng)大批量的樣品檢驗(yàn)工作。EP管法的檢出限達(dá)到0.1μg/100g，加標(biāo)回收率范圍為98.0%～107.5%，方法的重復(fù)性較好，且關(guān)鍵試劑（工作菌液、標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品稀釋液）在-20℃保存條件下6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性良好，具有微孔板法操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但成本較微孔板法大大降低。EP管法不但適用于測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的葉酸，還可應(yīng)用于其他以微生物法原理為基礎(chǔ)測(cè)定的維生素，如泛酸，維生素B12，生物素，肌醇和煙酸，適合在各級(jí)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。