復(fù)合酶酶解乳清制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化及應(yīng)用

沈荷玉，蔣瑩，唐婉婷，姜榮杰，周可強(qiáng)，李辰鳳，李誠

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625000）

0 引言

乳清是生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)物，約含0.6%的乳清蛋白，這部分乳清蛋白還沒有被大量開發(fā)利用[1-2]。工業(yè)化生產(chǎn)干酪會(huì)排放出大量的乳清，因此乳清資源豐富[3-4]。我國已將乳清作為原料研制各種乳清飲料[5-6]，且酶法水解的乳清飲料，感官性質(zhì)良好[7]。

乳清多肽有抗高血壓、抗氧化等多種功能，還可以改善乳清蛋白的加工性能，而近年來乳清功能性多肽的研究也已成為熱點(diǎn)[8-10]。本研究以鮮牛乳為原料，采用復(fù)合酶（中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）一步法酶解乳清制備抗氧化肽，以羥自由基清除率為指標(biāo)，優(yōu)化酶解工藝條件，并將在最佳酶解條件下制得乳清酶解液和其他配料一起調(diào)配成桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料，為乳清功能飲料的生產(chǎn)加工提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

鮮牛乳（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場生產(chǎn)）、水（GB/T6682規(guī)定的三級水）、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、37%甲醇、乙酰丙酮、鹽酸、中性蛋白酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙醇、乙酸、磷酸、硫酸鐵銨（均為分析純）。

1.1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Phs-3C+酸度計(jì)，方舟科技；JA12038電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；Varioskan las熒光酶標(biāo)儀，美國Thermo；Thermo Sorvall ST 16 ST16R通用臺式離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清制備

（1）巴氏殺菌：鮮牛乳76℃殺菌20 s，放入冰水降溫。

（2）脫脂：取50 mL離心管裝入樣品，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，4℃離心20 min。將下層清液（脫脂乳）沿管壁緩慢倒入燒杯，底部沉淀丟棄。

（3）制備乳清：使用磁力攪拌器（低速攪拌）和p H計(jì)，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH滴定至pH值為4.6，靜置30 min，用四層紗布過濾備用。

1.2.2 復(fù)合酶一步水解乳清的單因素實(shí)驗(yàn)

選擇不同酶解溫度（47.5，50，52.5，55，57.5℃），不同酶解pH值（6，6.5，7，7.5，8），不同酶量比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以羥自由基清除率為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來確定合適的酶解條件范圍，以便進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 復(fù)合酶一步水解乳清的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解溫度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3個(gè)因素為自變量，以乳清多肽的羥自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以Design-Expert8.0.6軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析[11]，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示。

1.2.4 桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料配制

（1）制備乳清。

（2）將制得乳清在羥自由基清除率最高的條件下水解得乳清水解液。

（3）枸杞子→挑選→清洗→除雜去?！鬯檫^篩（40目）→取枸杞粉→煮沸的乳清水解液浸泡30 min→四層紗布200目篩子過濾→取清液備用。

（4）桑葚干→挑選→清洗→除雜去?！鬯檫^篩（40目）→取桑葚粉→煮沸乳清水解液（用浸泡過枸杞過濾后的乳清水解液）浸泡30 min→四層紗布200目篩子過濾→取清液備用。

（5）取浸泡過枸杞粉和桑葚粉的乳清水解液→加入蜂蜜→加入檸檬酸→調(diào)配→均質(zhì)（20 MPa）→殺菌（121℃，5 min）→灌裝（100 mL玻璃瓶）→二次殺菌（121℃，1 min）→冷卻→成品。

工藝流程為：

1.2.5 桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料配方的正交實(shí)驗(yàn)

考慮到乳清多肽飲料產(chǎn)品配方的交互影響，以桑葚（A）、枸杞（B）、檸檬酸（C）、蜂蜜（D）為因素，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以感官評定作為指標(biāo)，確定桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料的最適配方。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定

參照國標(biāo)GB/T 5009.5-2016[12]。

1.3.2 羥自由基清除率的測定

在試管中加入0.5 mL濃度10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL樣液、0.5 mL濃度10 mmol/L的FeSO4溶液、3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL濃度100 mmol/L的H 2O 2啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測定吸光度A 1；取0.5 mL的蒸餾水代替濃度10 mmol/L的FeSO 4溶液所測得的吸光度為A2；取0.5 mL的蒸餾水代替水解液所測得的吸光度為A3[13]。

羥自由基的清除率P(%)

式中：A1為樣品平均吸光值；A2為對照組平均吸光值；A3為空白組平均吸光值。

1.3.3 感官評價(jià)

參照GB/T 29605-2013，由10人組成評價(jià)小組，按表2指標(biāo)對產(chǎn)品的色澤、味道、風(fēng)味等進(jìn)行綜合感官評價(jià)[14]。

表2 感官評定評分指標(biāo)

2 結(jié)果與討論

2.1 乳清中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

以光密度讀數(shù)A為縱坐標(biāo)，氨氮標(biāo)準(zhǔn)液氮含量C（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氨氮標(biāo)準(zhǔn)液氮含量C與吸光度A關(guān)系為A=0.0134C+0.007。

乳清樣品的吸光度A測定值為1.115，計(jì)算得蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5.3 mg/mL。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對復(fù)合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影響

由圖1可知，在其他因素相同的條件下，溫度為47.5，50，52.5℃時(shí)乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當(dāng)溫度為55℃時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大值58.41%；一方面，溫度過低，不能使蛋白酶的特殊空間結(jié)構(gòu)充分舒展，促使活性不能充分發(fā)揮[15]。另一方面，當(dāng)溫度升高時(shí)，酶活力有所下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)裂解肽鍵的速度減慢，小分子的肽數(shù)目減少，清除自由基的能力下降，所以乳清多肽的羥自由基清除率反而降低[16]。溫度的改變影響復(fù)合酶的活性，在適宜溫度范圍內(nèi)，溫度升高，蛋白酶水解能力增強(qiáng)，進(jìn)而影響具有抗氧化功能的酶解物含量。因此確定溫度55℃比較適合復(fù)合酶的一步酶解。

圖1 溫度對羥自由基清除率的影響

2.2.2 p H值對復(fù)合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影響

由圖2可知，在其他因素相同的條件下，pH值為6時(shí)乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當(dāng)pH值為6.5時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大值52.41%；當(dāng)p H值不斷增大時(shí)，乳清多肽的羥自由基清除率反而不斷降低。溶液p H是決定復(fù)合蛋白酶催化活性的重要參數(shù)之一，過高或者過低都會(huì)對酶解反應(yīng)產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致羥自由基清除率下降[17-18]。因此確定p H值為6.5是比較適合復(fù)合酶的一步酶解。

圖2 pH值對羥自由基清除率的影響

2.2.3 酶比對復(fù)合酶一步水解得抗氧化肽的影響

由圖3可知，在其他因素相同的條件下，酶比為1∶1和2∶1時(shí)乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當(dāng)酶比為3∶1時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大值49.11%；當(dāng)酶比增大時(shí)，乳清多肽的羥自由基清除率反而降低。酶比的改變影響酶解效果，每一種酶有專一的酶切位點(diǎn)，專一性不同的兩種酶組合起來，能更多地切斷多肽鏈，因而提高酶解效果[19]。因此確定酶比3∶1比較適合復(fù)合酶的一步酶解。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

圖3 酶比對羥自由基清除率的影響

表3 水解方案響應(yīng)面分析及結(jié)果

采用響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以羥自由基清除率為響應(yīng)值，結(jié)果如表3所示。

2.3.1 響應(yīng)面分析及方差分析

根據(jù)表1,采用Design-Expert8.0.6軟件對表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，對各因素回歸擬合后，得出羥自由基清除率對溫度（A）、pH值（B）、酶比（C)的回歸模型，回歸方程為：

由表4可以看出，A2和C2對羥基自由基清除率影響高度顯著，B2對羥基自由基清除率影響顯著，A對羥基自由基清除率影響較顯著。其中，失擬項(xiàng)=0.9909（＞0.05）即失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該回歸模型能夠較顯著擬合。溫度、pH值、酶比對羥基自由基清除率的影響，該模型能夠代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3.2 最優(yōu)水解條件的預(yù)測及驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測，即對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于0，得到羥自由基清除率最高的最佳水解參數(shù)：溫度55.22℃，pH值為6.46，酶比31∶10，在此條件下羥基自由基清除率的值為68.08%。在此條件下對模型的預(yù)測參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到羥自由基清除率為67.70%，與模型預(yù)測值接近，表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的水解條件是可靠的。

表4 響應(yīng)面ANOVA分析結(jié)果

2.3.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

響應(yīng)面可以反映出各因素間交互作用的顯著性，曲面變化相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小[20]。由圖4可知，溫度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3個(gè)因素之間存在交互作用。圖4（a）為溫度與p H值的交互結(jié)果：響應(yīng)面曲面坡度較陡峭，且溫度更為陡峭，說明二者交互作用顯著，溫度的影響大于pH值的影響。圖4（b）為溫度和酶比的交互結(jié)果：響應(yīng)面曲面坡度較陡峭，且溫度更為陡峭，說明二者交互作用顯著，溫度的影響大于酶比的影響。圖4（c）為p H值和酶比的交互結(jié)果：響應(yīng)面較為平緩，且等高線呈圓形，說明兩者交互作用不顯著。

2.4 桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料配方優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可得，影響桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料風(fēng)味的主次關(guān)系為B、A、C、D。正交試驗(yàn)最適配方為A3B3C2D1，即檸檬酸0.13%、蜂蜜5.5%、桑葚4.0%、枸杞1.2%，該配方產(chǎn)品色澤均勻，口感酸甜，品質(zhì)穩(wěn)定。

表6表明，檸檬酸量、桑葚量、枸杞量對飲料最終口感的影響不顯著，而蜂蜜量對口感的影響顯著，直接影響飲料的酸甜風(fēng)味。

3 結(jié)果與討論

目前，酶法制備乳清多肽一般都采用單一酶酶解制備的方法，如李雪等采用胃蛋白酶酶解乳清制備多肽[21]，唐艷等采用中性蛋白酶酶解乳清制備多肽[22]。但復(fù)合酶酶解乳清蛋白，可以結(jié)合不同酶的酶切位點(diǎn)，更多的切斷多肽鏈，促進(jìn)酶解過程，提升乳清多肽的抗氧化性。多數(shù)乳清飲料研究采用乳清直接調(diào)配制備乳清飲料，如孟昭噓等以食用仙人掌、白糖等和乳清混合調(diào)配成仙人掌乳清飲料[23]。但利用乳清直接調(diào)配飲料時(shí)，熱處理往往導(dǎo)致乳清蛋白的變性沉淀，十分影響產(chǎn)品的感官特性和營養(yǎng)價(jià)值，而酶水解正是改善乳清蛋白溶解性的有效方法。

圖4 各因素交互作用對乳清多肽羥基自由基清除率影響的響應(yīng)面

表6 感官評定方差分析結(jié)果

復(fù)合酶酶解制備抗氧化肽的最優(yōu)酶解工藝條件為溫度為55.22℃，pH值為6.46，酶比（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）為31∶10。經(jīng)過驗(yàn)證與對比實(shí)驗(yàn)可知在最優(yōu)酶解工藝條件下羥自由基清除率可達(dá)到67.70%。且利用響應(yīng)面分析三個(gè)因素的交互作用的影響順序是：溫度＞酶比＞pH值。以酶解的乳清液為基本原料制備的桑葚枸杞乳清多肽復(fù)合飲料配方為：桑葚4.0%，枸杞1.2%，檸檬酸0.13%，蜂蜜5.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。