生鮮乳中嗜冷菌檢驗(yàn)的兩種培養(yǎng)條件比較

吉玲

（上海旺旺食品集團(tuán)有限公司，上海201103）

0 引言

牛乳營(yíng)養(yǎng)豐富，同時(shí)也是微生物的良好培養(yǎng)基，屬于高營(yíng)養(yǎng)易腐敗的食品。嗜冷菌是影響牛乳保質(zhì)期的主要因素。嗜冷菌在原料乳低溫儲(chǔ)存運(yùn)輸過程中可大量繁殖，其經(jīng)過巴氏殺菌或UHT滅菌可以被殺滅，但其產(chǎn)生的耐熱酶[1]經(jīng)過熱處理后仍然殘留。這些耐熱酶在乳制品儲(chǔ)藏銷售過程中被激活，會(huì)分解蛋白、脂肪，從而導(dǎo)致乳制品發(fā)生感官變化，出現(xiàn)脂肪上浮、蛋白沉淀、苦味、脂肪氧化味[2]等現(xiàn)象，給乳品品質(zhì)造成較嚴(yán)重的不良影響。并且，嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱酶使乳品中蛋白、脂肪等成分穩(wěn)定性下降，加工過程中易在設(shè)備管路內(nèi)表面結(jié)垢，尤其是導(dǎo)致板式熱交換器板片結(jié)垢嚴(yán)重，需要增加清洗強(qiáng)度及頻次，從而增加設(shè)備清洗成本及產(chǎn)能降低。生鮮乳中嗜冷菌的檢測(cè)和管控很有必要，并且也被國(guó)內(nèi)外乳品企業(yè)及研究單位所關(guān)注。生乳中的嗜冷菌種類繁多，有細(xì)菌、放線菌、霉菌、低溫藻類等。細(xì)菌是數(shù)量和種類最多的一類，涉及30多個(gè)屬[3-11]。所以，嗜冷菌快速計(jì)數(shù)方法面臨針對(duì)性和全面性兩個(gè)挑戰(zhàn)性問題。低溫培養(yǎng)法是能篩選出嗜冷菌，較全面計(jì)數(shù)的較準(zhǔn)確的方法。本實(shí)驗(yàn)參照SN/T 2552.4-2010[12],通過大量對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較了6.5℃10 d菌落計(jì)數(shù)[13]和21℃培養(yǎng)25 h菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的差異，確認(rèn)21℃培養(yǎng)25 h的嗜冷菌快速計(jì)數(shù)方法能否替代6.5℃培養(yǎng)10 d的計(jì)數(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌釜，日本三洋；lab dancer旋渦振蕩器，IKA；CA-1390-1超凈工作臺(tái)，上海上凈；SHP150生化培養(yǎng)箱，上海精宏；Galaxy 230菌落計(jì)數(shù)器，美國(guó)Sciencetool；HWS 12恒溫水浴鍋，上海一恒；DHG-9240A恒溫干燥箱，上海一恒。

乳平板計(jì)數(shù)瓊脂MPC，北京陸橋；磷酸鹽緩沖液，北京陸橋。

山東旺旺食品有限公司收購(gòu)的生鮮乳，抽取樣品數(shù)90個(gè)，編號(hào)sample1、sample2、sample3、……、sample90。比對(duì)實(shí)驗(yàn)分6日完成，每日實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)為15個(gè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

樣品稀釋：根據(jù)以往生鮮乳驗(yàn)收嗜冷菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，收購(gòu)的生鮮乳嗜冷菌含量一般在101～105CFU/mL范圍，故實(shí)驗(yàn)取10-1、10-2、10-33個(gè)稀釋度的樣液接種。第一步稀釋，充分振蕩混勻初始生鮮乳樣品原液，無菌吸取樣品25 mL，加入225 mL的無菌磷酸鹽緩沖液中，充分振搖混合均勻，稀釋成10-1稀釋度的樣液；吸取10-1稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，旋渦振蕩制成10-2稀釋度；吸取10-2稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，制成10-3稀釋度的樣品勻液。

接種：10-1、10-2、10-3稀釋度，每個(gè)稀釋度接種4個(gè)平皿，每皿加樣1 mL，每皿傾注冷卻至46℃的無菌MPC培養(yǎng)基15 mL～20 mL。

培養(yǎng)：待瓊脂凝固干燥后，每個(gè)稀釋度2個(gè)平皿倒置于6.5±0.5℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d；另外2個(gè)只平皿倒置于21±1℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)25 h。菌落觀察計(jì)數(shù)，選取菌落數(shù)在10～300 CFU內(nèi)的平板計(jì)數(shù)，計(jì)算樣品中嗜冷菌含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

90個(gè)生鮮乳樣品，經(jīng)6.5℃培養(yǎng)10 d，21℃培養(yǎng)25 h，分別計(jì)數(shù)，計(jì)算嗜冷菌濃度。其中75個(gè)樣品，即83.3%比例的樣品，6.5±0.5℃10 d培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的對(duì)數(shù)值與21℃25 h培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的對(duì)數(shù)值之差的絕對(duì)值＞0.5 log10[14]，最大差異3.88 log10。

90個(gè)樣本中88個(gè)樣本，即97.8%比例的樣本，21℃25 h培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果高于6.5℃10 d的計(jì)數(shù)結(jié)果，如下圖1所示。

圖1 生鮮乳6.5℃，10 d計(jì)數(shù)與21℃，25 h計(jì)數(shù)結(jié)果

6.5 ℃培養(yǎng)10 d，21℃培養(yǎng)25 h兩種條件培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果之對(duì)數(shù)值，應(yīng)用CORREL函數(shù)[15]，求得其相關(guān)系數(shù)僅為0.30；依兩種培養(yǎng)條件計(jì)數(shù)結(jié)果之對(duì)數(shù)值的相關(guān)方程為y=0.8377x-0.7552，相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.0907，如圖2所示。由此可以看出6.5℃培養(yǎng)10 d、21℃培養(yǎng)25 h兩種條件培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果為非相關(guān)性。

2.2 分析討論

圖2 生鮮乳6.5℃，10 d與21℃，25 h計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性

據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中90個(gè)生鮮乳樣本嗜冷菌檢測(cè)結(jié)果，6.5℃培養(yǎng)10 d計(jì)數(shù)與21℃培養(yǎng)25 h計(jì)數(shù)結(jié)果存在顯著差異（P＜0.01），因?yàn)閮煞N溫度條件可培養(yǎng)出的嗜冷微生物的種類不同。21℃培養(yǎng)25 h計(jì)數(shù)結(jié)果高于6.5℃培養(yǎng)10 d計(jì)數(shù)結(jié)果，可能因?yàn)?1℃條件下除了專性嗜冷菌可生長(zhǎng)，一些兼性嗜冷微生物也可被培養(yǎng)篩選出來。所以，兩種條件培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果也不存在相關(guān)性。

乳品企業(yè)對(duì)生鮮乳中嗜冷菌監(jiān)測(cè)時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需要選擇相應(yīng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法。若為了保障乳品品質(zhì)，確保安全衛(wèi)生，則可選擇21℃培養(yǎng)25 h計(jì)數(shù)的方法，該方法具有較大的包容性，可檢出較大范圍種類的嗜冷微生物群；若除了保障乳品的安全衛(wèi)生，同時(shí)還需要研究和確認(rèn)其實(shí)際專性嗜冷菌含量水平，以分析專性嗜冷菌含量與加工工藝及成品貨架期內(nèi)品質(zhì)的相關(guān)性，則選擇6.5℃培養(yǎng)10 d計(jì)數(shù)的方法可能更有意義。另外，乳品企業(yè)也可以在不同收購(gòu)、儲(chǔ)存、加工等不同的管控環(huán)節(jié)，選擇相應(yīng)的培養(yǎng)溫度時(shí)間進(jìn)行嗜冷菌計(jì)數(shù)，例如，對(duì)于牧場(chǎng)生乳嗜冷菌含量檢驗(yàn)時(shí)，則選擇21℃培養(yǎng)25 h計(jì)數(shù)的快速方法，有利于更迅速地評(píng)估各奶戶的生乳衛(wèi)生狀態(tài)，以便發(fā)現(xiàn)問題，及時(shí)反饋，便于奶戶盡快改善。對(duì)于巴殺前奶倉(cāng)中生乳混合奶樣的嗜冷菌檢測(cè)采用6.5℃培養(yǎng)10 d或6.5℃10 d與21℃培養(yǎng)25 h同步培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方案。

3 結(jié)語(yǔ)

生鮮乳中微生物含量的高低反映了其品質(zhì)的優(yōu)劣，為了保障消費(fèi)者安全和健康，及降低乳品加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)生乳原料中的嗜冷微生物的檢測(cè)及控制是有必要的。生鮮乳中嗜冷菌含量高時(shí)，在儲(chǔ)運(yùn)過程繼續(xù)大量繁殖，則會(huì)產(chǎn)生大量的耐熱酶類，導(dǎo)致乳中蛋白、脂肪、乳糖等營(yíng)養(yǎng)成分分解，從而使UHT工藝過程面臨較大的挑戰(zhàn)，也會(huì)影響貨架期內(nèi)產(chǎn)品的風(fēng)味、穩(wěn)定性。乳品企業(yè)期望嗜冷菌能作為常規(guī)驗(yàn)收項(xiàng)目，但現(xiàn)行的培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)需要的檢測(cè)周期至少25 h，不適用于生鮮乳的實(shí)時(shí)驗(yàn)收。所以乳品行業(yè)迫切需要一個(gè)精確可靠，靈敏度高的，可操作性高，且成本低的，好的嗜冷菌快速檢測(cè)方法。