苗藥紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝研究

薛寸 吳耽 鞏仔鵬 陳思穎 唐娟 李月婷 王愛民 李勇軍 蘭燕宇 王永林

中圖分類號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）14-1683-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.04

摘 要 目的：探索苗藥紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝特征。方法：取紅禾麻藥材，以70%乙醇回流提取，經(jīng)濃縮、正丁醇萃取、干燥后，得紅禾麻提取物。將0.05 g/mL紅禾麻提取物溶液1 mL與離體人腸道菌液10 mL混合后，在厭氧環(huán)境下共同培養(yǎng)36 h（同時(shí)設(shè)置不含藥物或人腸道菌液的空白對照），模擬該提取物在人體腸道內(nèi)的代謝過程。采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF/MS）對厭氧反應(yīng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，流動(dòng)相為0.01%甲酸水溶液-0.01%甲酸乙腈溶液（梯度洗脫），柱溫為40 ℃，流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為1 ?L;采用電噴霧離子源（ESI），以負(fù)離子模式（ESI-）掃描，毛細(xì)管電壓為4.5 kV，離子源溫度為120 ℃，碰撞能為15～32 V，掃描范圍為m/z 50～1 000。采用MassLynx V4.1軟件中的“Strip”模塊分析獲得紅禾麻提取物反應(yīng)液與空白對照的差異圖譜。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和UNIFI軟件進(jìn)行代謝產(chǎn)物的相對分子量和分子式預(yù)測，結(jié)合對照品信息和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，推測紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其可能的生物轉(zhuǎn)化途徑。結(jié)果與結(jié)論：紅禾麻提取物經(jīng)離體人腸道菌群代謝后，共檢出3個(gè)原型產(chǎn)物（蘆丁、槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷）和22個(gè)代謝產(chǎn)物（主要為槲皮素、單咖啡?；鼘幩?、異槲皮苷等的代謝產(chǎn)物），其主要生物轉(zhuǎn)化途徑是以還原、氧化、水解為主的Ⅰ相反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 紅禾麻;離體人腸道菌群;代謝;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);鑒定

Study on Metabolism of Miao Medicine Laportea bulbifera Extract in Isolated Human Intestinal Flora

XUE Cun1，WU Dan2，GONG Zipeng1，CHEN Siying1，TANG Juan3，LI Yueting1，WANG Aimin1，LI Yongjun1， LAN Yanyu1，WANG Yonglin1（1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical preparations/School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. Key Laboratory of Natural Products Chemistry of Guizhou Provincial Science City， Guiyang 550014， China; 3. Phase Ⅰ Ward， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the metabolic characteristics of Miao medicine Laportea bulbifera extract in isolated human intestinal flora. METHODS： L. bulbifera was extracted with 70% ethanol reflux extraction. After concentration， extraction with n-butanol and drying， L. bulbifera extract was obtained. Taking 0.05 g/mL L. bulbifera extract 1 mL mixed with isolated human intestinal flora fluid 10 mL and cultured for 36 h in anaerobic environment （setting up blank control without drugs or human intestinal bacterial solution）， so as to simulate the metabolic process of the extract in human intestine. The metabolites were detected by UPLC-Q-TOF/MS. The determination was performed on Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column with mobile phase consisted of 0.01% formic acid water solution-0.01% formic acid acetonitrile solution （gradient eluetion） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and the sample size was 1 ?L. ESI detection was adopted and scanned by negative ion mode （ESI-）; the capillary voltage was 4.5 kV， the ion source temperature was 120 ℃， the collision energy was 15-32 V， and the scanning range was m/z 50-1 000. The “Strip” module of MassLynx V4.1 software was used to analyze the differential chromatograms between the reaction solution and the blank control of L. bulbifera extract. Mass spectrum data and UNIFI software were used to predict relative molecular weight and formula; based on the information of substance control and related literature reports， the structure and biotransformation pathway of L. bulbifera metabolites in isolated human intestinal flora were predicted and analyzed. RESULTS & CONCLUSIONS： A total of 3 prototype products （rutin， quercetin， kaempferol-3-O-rutinoside） and 22 metabolites（mainly the metabolites of quercetin，mono- caffeoylquinic acid，isoquercitrin，etc.） were detected after metabolized in isolated human intestinal flora. Its biotransformation pathway is phase Ⅰ reaction， which mainly consisted of reduction， oxidation and hydrolysis.

KEYWORDS? ?Laportea bulbifera; Isolated human intestinal flora;Metabolism;UPLC-Q-TOF/MS; Identification

紅禾麻為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻[Laportea bulbifera（Sieb. et Zucc.）Wedd.]的新鮮或干燥全草，又名紅活麻、野綠麻、華中艾麻等，為貴州苗族常用藥材，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀之功效，對風(fēng)濕麻木、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌撲損傷以及骨折等癥有獨(dú)特療效[1-2]。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，紅禾麻中主要含有黃酮類、內(nèi)酯類、糖類及鞣質(zhì)等成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等藥理作用[3-7]。本課題組前期考察了紅禾麻提取物在大鼠體內(nèi)的原型入血成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要為黃酮類和酚酸類：5個(gè)黃酮類原型成分為蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，3個(gè)酚酸類原型成分為3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩?、5-O-咖啡?；鼘幩?進(jìn)一步的藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)研究顯示，上述入血成分的藥效發(fā)揮時(shí)間均滯后于其血藥濃度達(dá)峰時(shí)間，分析原因可能是入血的原型成分在大鼠體內(nèi)發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其代謝產(chǎn)物與原型成分共同發(fā)揮了藥理作用[8]。

人體腸道中棲息著最主要和最多樣的微生物，這些微生物被統(tǒng)稱為腸道菌群。腸道菌群作為人體“隱形器官”，在藥物的藥效、毒性、生物利用度及代謝方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。傳統(tǒng)中藥大多數(shù)是通過口服吸收而發(fā)揮藥效，而藥物在生物體內(nèi)不可避免地會(huì)與腸道菌群接觸[11]，因此中藥的藥效成分可能在吸收入血之前就已經(jīng)在腸道內(nèi)與腸道菌群發(fā)生了相互作用，這可能導(dǎo)致其成分活性、毒性以及生物利用度的改變等[12-13]?；诖?，本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，將苗藥紅禾麻提取物與離體人腸道菌群共同進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，模擬該提取物在人體腸道中的代謝過程;同時(shí)，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF/MS）對代謝后的產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，以明確紅禾麻提取物的代謝產(chǎn)物及代謝途徑，旨在為闡明該藥材中各化學(xué)成分在腸道中的代謝規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

G2-XS Q-TOF型UPLC-Q-TOF/MS儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站（美國Waters公司）;DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋、CDH6000BⅡ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）;EL204 型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;Buchi R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 Buchi 公司）;KQ-2200DE型超聲波清洗機(jī)（昆山舒美超聲儀器有限公司）;AnaeroPack-Anaero型厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)罐（日本MGC公司）;MTN-2800D型氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）;YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

紅禾麻藥材于2017年采收自貴州地區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫慶文副教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻[L. bulbifera（Sieb. et Zucc.）Wedd.]的干燥全草;蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100080-201610、112007-201602、111720-201408、111809-201403、111538-201606，純度均不低于98%）;5-O-咖啡?；鼘幩?、3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩釋φ掌罚ń靼鄄菰瓷锟萍加邢薰?，批號(hào)分別為BCY-0921、BCY-0414、BCY-0920，純度均不低于98%）;亮氨酸腦啡肽液（美國Waters公司，批號(hào)：W29061508）;厭氧培養(yǎng)液粉末（青島高科技工業(yè)園博海生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20161025）;氯化鈉注射液（貴州科倫藥業(yè)有限公司，規(guī)格：250 mL ∶ 2.25 g;作生理鹽水用）;乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 人體糞便

人體糞便均來自于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院招募的健康成年志愿者的新鮮糞便樣本。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅禾麻提取物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)方法[14]，稱取紅禾麻藥材5 kg，先后加入10、8、8倍量（L/kg，下同）70%乙醇加熱回流提取，每次分別提取2、1.5、1.5 h，濾過;合并濾液，水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味。將上述醇提物濃縮液用水稀釋至1 g/mL（以原藥材量計(jì)），加入等體積水飽和正丁醇萃取，共萃取3次;合并正丁醇萃取液，水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，殘留物進(jìn)行真空干燥，得紅禾麻正丁醇萃取物，即為紅禾麻提取物（以原藥材質(zhì)量計(jì)算其提取率為4.03%）。

2.2 紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝反應(yīng)

2.2.1 紅禾麻提取物藥液制備 取“2.1”項(xiàng)下所制備的紅禾麻提取物1 g，加入50%甲醇100 mL，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz，下同）30 min使充分溶解，然后以8 000 r/min離心5 min，取上清液，水浴揮干，粉碎，得揮干物固體粉末0.6 g（轉(zhuǎn)移率約為60%）。稱取該揮干物粉末適量，用生理鹽水制備成質(zhì)量濃度為0.05 g/mL（以揮干物質(zhì)量計(jì)）的紅禾麻提取物藥液，備用。

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取5-O-咖啡?；鼘幩?、3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡酰基奎寧酸、蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷對照品適量至量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解后并以甲醇定容，混勻，制成各單一對照品貯備液，于-20 ℃避光保存。臨用前，分別取各貯備液適量，以甲醇適當(dāng)稀釋后即得。

2.2.3 厭氧培養(yǎng)液制備 取厭氧培養(yǎng)液粉末9 g，加至水1 L中，超聲溶解后，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

2.2.4 人腸道菌液制備 取人體糞便樣本適量，加入4倍量生理鹽水，混勻，渦旋混合3 min，以6 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2.5 分組代謝反應(yīng) 取“2.2.4”項(xiàng)下人腸道菌液1 mL，加至“2.2.3”項(xiàng)下厭氧培養(yǎng)液9 mL中，混勻后迅速置于厭氧培養(yǎng)罐中，加入1個(gè)厭氧產(chǎn)氣袋后蓋上培養(yǎng)罐蓋，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使人腸道菌液中的細(xì)菌充分生長。試驗(yàn)分為給藥組、空白對照A組、空白對照B組。給藥組：將厭氧培養(yǎng)24 h后的人腸道菌液10 mL與紅禾麻提取物溶液1 mL混合均勻，立即置于厭氧培養(yǎng)罐中，加入1個(gè)厭氧產(chǎn)氣袋后迅速蓋上培養(yǎng)罐蓋，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h;空白對照A組：將厭氧培養(yǎng)24 h后的人腸道菌液10 mL（不加紅禾麻提取物），按給藥組“立即置于厭氧培養(yǎng)罐……培養(yǎng)36 h”步驟同法操作;空白對照B組：將厭氧培養(yǎng)液10 mL和紅禾麻提取物溶液1 mL混合，按給藥組“立即置于厭氧培養(yǎng)罐……培養(yǎng)36 h”步驟同法操作。各組均平行3份樣品操作。將培養(yǎng)完畢的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50 mL EP管中，于? -20 ℃條件下保存，備用。所用器具均經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2.3 紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中代謝反應(yīng)樣品的測定

參照文獻(xiàn)方法[8，14]，采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)測定分組代謝產(chǎn)物。

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相：0.01%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～1.5 min，5%B;1.5～6 min，5%B→9%B;6～9 min，9%B;9～11 min，9%B→12%B;11～13 min，12%B→15%B;13～25 min，15%B→20%B;25～26 min，20%B→70%B;26～27 min，70%B→95%B;27～28 min，95%B;28～30 min，95%B→5%B;30～32 min，5%B）;柱溫：40 ℃;流速：0.25 mL/min;進(jìn)樣量：1 ?L。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負(fù)離子模式（ESI-）;掃描范圍：m/z 50～1 000;掃描方式：MS Continuum模式;毛細(xì)管電壓：4.5 kV;離子源溫度：120 ℃;霧化氣（N2）壓力：1.2 bar;去溶劑氣溫度：300 ℃;脫溶劑氣流量：600 L/h;錐孔氣流量：50 L/h;碰撞能：15～32 V。采用外標(biāo)亮氨酸腦啡肽（m/z 554.262 0

[M-H]-，Lock SprayTM模式）進(jìn)行實(shí)時(shí)采集校正;采用MassLynx V4.1工作站進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理。

2.3.3 代謝反應(yīng)樣品的預(yù)處理及測定 取“2.2.5”項(xiàng)下各組反應(yīng)樣品，室溫解凍后同組混勻，取一半混合液分別轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入等體積乙酸乙酯，渦旋3 min后再超聲8 min進(jìn)行萃取，然后以8 000 r/min離心5 min，取上清液;下層再按同樣的步驟提取1次，離心后取上清液;再向下層中加入等體積水飽和正丁醇，同法萃取，共萃取2次;合并4次萃取液，于37 ℃下以N2吹干。殘?jiān)尤?0%甲醇500 ?L，渦旋混勻，超聲使其溶解，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。

2.4 紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝產(chǎn)物鑒定分析

經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)測得的紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中代謝產(chǎn)物的基峰圖見圖1A～1C，采用MassLynx V4.1工作站軟件獲得準(zhǔn)分子離子高分辨質(zhì)量數(shù)及其碎片離子信息;采用MassLynx V4.1軟件中的“Strip”模塊進(jìn)行差異圖譜分析，得基峰圖，見圖1D。根據(jù)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合 UNIFI 軟件進(jìn)行代謝產(chǎn)物預(yù)測、篩查[15-16]，再通過與已知對照品比對保留時(shí)間、相對分子量、碎片離子來確定原型成分;利用高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)及其誤差值、保留時(shí)間、原型成分的裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)[8，17-19]進(jìn)行代謝物推測分析。結(jié)果，從紅禾麻提取物的反應(yīng)液中鑒定出3個(gè)原型成分和22個(gè)代謝產(chǎn)物，其分析結(jié)果見表1，其代謝途徑見圖2。

2.5 原型產(chǎn)物解析

M1、M2、M12：分別在保留時(shí)間17.02、20.50、19.69 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 609.144 5[M-H]-、m/z 447.092 9[M-H]-、m/z 593.153 5[M-H]-，通過Mass- Lynx V4.1工作站軟件（下同）預(yù)測其分子式為C27H29O16、C21H19O11、C27H29O15，與蘆丁、槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品的相對分子量和保留時(shí)間均一致，由此確定M1為蘆丁、M2為槲皮苷、M12為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

2.6 代謝產(chǎn)物解析

M3：在保留時(shí)間4.08 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 329.029 2[M-H]-，通過軟件預(yù)測分子式為C16H9O8;出現(xiàn)碎片離子m/z 301.034 6[M-H]-（預(yù)測分子式為C15H9O7，下同），相對分子量較其準(zhǔn)分子離子m/z 329.029 2少了28，根據(jù)軟件推測此準(zhǔn)分子離子可能是由槲皮素羰基化而得;再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8，17]，推測M3是槲皮素羰基化的代謝產(chǎn)物。

M9：在保留時(shí)間12.35 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 317.066 7[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C16H13O7;出現(xiàn)碎片離子m/z 301.034 6[M-H]-（C15H9O7）、m/z 299.020 3[M-H]-（C15H7O7）、m/z 273.039 2[M-H]-（C14H9O6）、m/z 255.029 4[M-H]-（C14H7O5），其中碎片離子m/z 301.034 6的相對分子量較其準(zhǔn)分子離子m/z 317.066 7少了16，而碎片離子m/z 299.020 3、273.039 2、255.029 4為槲皮素的特征碎片離子[17]，故推測M9是槲皮素還原、甲基化的代謝產(chǎn)物。

M13、M15：在保留時(shí)間4.58、8.10 min處，分別出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 181.050 6[M-H]-、m/z 167.035 3[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C9H9O4、C8H7O4;出現(xiàn)碎片離子m/z 167.035 0[M-H]-（C8H7O4），相對分子量較其準(zhǔn)分子離子m/z 181.050 6少了14，故推測化合物M13為化合物槲皮素O—C2鍵開環(huán)裂解、甲基化的代謝產(chǎn)物;結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14]和相對分子量分析，M15可能是槲皮素O—C2鍵開環(huán)裂解的代謝產(chǎn)物。

M16：在保留時(shí)間9.07 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 195.066 1[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C10H11O4;出現(xiàn)碎片離子m/z 181.050 3[M-H]-（C9H9O4）、m/z 167.034 0[M-H]-（C8H7O4），分別與M13、M15的準(zhǔn)分子離子對應(yīng)，再根據(jù)軟件推算分子式并推測準(zhǔn)分子離子可能的代謝途徑為槲皮素O—C2鍵開環(huán)裂解、二甲基化，故推測M16可能是化合物槲皮素O—C2鍵開環(huán)裂解、二甲基化的代謝產(chǎn)物。

M11：在保留時(shí)間17.55 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 331.044 3[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C16H11O8;出現(xiàn)碎片離子m/z 301.034 3[M-H]-（C15H9O7），相對分子量較其準(zhǔn)分子離子m/z 331.044 3少了30，故推測M11可能是槲皮素羥基化、甲基化的代謝產(chǎn)物。

M21：在保留時(shí)間16.27 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 301.034 5[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C15H9O7;出現(xiàn)碎片離子m/z 273.039 0[M-H]-（C14H9O6）、m/z 245.044 1[M-H]-（C13H9O5）、m/z 151.003 2[M-H]-（C8H7O3），均為槲皮素特征碎片離子[17]，通過軟件推測此準(zhǔn)分子離子可能是由蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷脫糖而得;結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8，18]，推測M21可能是蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷脫糖的代謝產(chǎn)物槲皮素。

M25：在保留時(shí)間17.15 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 431.098 6[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C21H19O10。此準(zhǔn)分子離子的相對分子量較槲皮苷準(zhǔn)分子離子m/z 447.092 9少了16，故推測M24可能是槲皮苷脫羥基的代謝產(chǎn)物。

M8：在保留時(shí)間9.95 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 477.103 7[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C22H21O12;出現(xiàn)碎片離子m/z 463.089 2[M-H]-（C21H19O12），相對分子量較其準(zhǔn)分子離子m/z 477.103 7少了14;結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18]，推測M8是異槲皮苷甲基化的代謝產(chǎn)物。

M19：在保留時(shí)間11.52 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 625.140 9[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C27H29O17;出現(xiàn)碎片離子m/z 301.034 9[M-H]-（C15H9O7）、135.045 2[M-H]-（C8H7O2）。由于其準(zhǔn)分子離子的相對分子量較蘆丁準(zhǔn)分子離子m/z 609.144 5多了16，而2個(gè)碎片離子m/z 301.03 4、135.045 2為蘆丁特征碎片離子[18]，故推測M19是蘆丁羥基化的代謝產(chǎn)物。

M14：在保留時(shí)間4.96 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 357.117 6[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C16H21O9。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19]推測，該準(zhǔn)分子離子的相對分子量較單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353多了4，故推測M14可能是單咖啡?；鼘幩徇€原的代謝產(chǎn)物。

M4、M6：在保留時(shí)間7.63、8.74 min處，分別出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 353.088 0[M-H]-（C16H17O9）、m/z 353.088 5

[M-H]-（C16H17O9）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19]，兩者的相對分子量與單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353[M-H]-相等，但保留時(shí)間與3-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡?；鼘幩?、5-O-咖啡酰基奎寧酸[8]均不同，故推測M4、M6可能是單咖啡?；鼘幩岙悩?gòu)化的代謝產(chǎn)物。

M5：在保留時(shí)間7.93 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 367.103 7[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C17H19O9;出現(xiàn)碎片離子m/z 179.034 2[M-H]-（C9H7O4）。其中，其準(zhǔn)分子離子的相對分子量較單咖啡酰基奎寧酸準(zhǔn)分子離子m/z 353少了14，其碎片離子m/z 179.034 2為單咖啡?；鼘幩岬奶卣魉槠x子[19]，故推測M5可能是單咖啡?；鼘幩峒谆拇x產(chǎn)物。

M10：在保留時(shí)間13.10 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 325.093 2[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C15H17O8;出現(xiàn)碎片離子m/z 191.056 5[M-H]-（C7H11O6）、m/z 179.034 9[M-H]-（C9H7O4），均為單咖啡?；鼘幩崃呀獾奶卣魉槠x子[19];同時(shí)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19]，其準(zhǔn)分子離子的相對分子量較單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353[M-H]-少了28，故推測M16可能是單咖啡?；鼘幩崦擊驶拇x產(chǎn)物。

M17、M18：在保留時(shí)間9.38、10.45 min處，分別出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 339.108 4[M-H]-（C16H19O8）、m/z 339.108 8[M-H]-（C16H19O8）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19]，兩者的相對分子量均較單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353[M-H]-少了14，故推測化合物M17、M18可能是單咖啡酰基奎寧酸脫羥基還原的代謝產(chǎn)物。

M7：在保留時(shí)間9.59 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 367.103 2[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C17H19O9。此準(zhǔn)分子離子的相對分子量較單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353[M-H]-[19]多了14，故推測M7可能是單咖啡?；鼘幩峒谆拇x產(chǎn)物。

M20：在保留時(shí)間12.65 min處，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 369.118 4[M-H]-，通過軟件預(yù)測其分子式為C17H21O9。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19]，此準(zhǔn)分子離子的相對分子量較單咖啡?；鼘幩釡?zhǔn)分子離子m/z 353[M-H]-多了16，根據(jù)軟件可推測此準(zhǔn)分子離子可能是由單咖啡?；鼘幩徇€原、甲基化而得，故推測M20可能是單咖啡酰基奎寧酸還原、甲基化的代謝產(chǎn)物。

M22、M23、M24：在保留時(shí)間15.40、16.09、16.35 min處，分別出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子m/z 607.166 4[M-H]-（C28H31O15）、m/z 607.166 9[M-H]-（C28H31O15）、607.167 8 [M-H]-（C28H31O15）;出現(xiàn)碎片離子m/z 593.150 8[M-H]-（C27H29O15）、m/z 593.150 7[M-H]-（C27H29O15）、m/z 593.149 4[M-H]-（C27H29O15）、m/z 315.050 7[M-H]-（C16H11O7）、m/z 301.036 3[M-H]-（C15H9O7）、m/z 301.036 2[M-H]-（C15H9O7）。其中，碎片離子m/z 593.150 8與山柰酚-3-O-蕓香糖苷準(zhǔn)分子離子m/z 593.153 5一致，相對分子量均較上述準(zhǔn)分子離子m/z 607.166 4、607.166 9、607.167 8少了14，推測上述準(zhǔn)分子離子可能是由山柰酚-3-O-蕓香糖苷甲基化而得，故推測M21、M22、M23可能是山柰酚-3-O-蕓香糖苷甲基化的代謝產(chǎn)物。

3 討論

本文采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)檢測了苗藥紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝產(chǎn)物，為該藥材提取物體內(nèi)過程的定性分析提供了一種高效、靈敏、快速的分析方法[13]。該方法在32 min內(nèi)即可完成對復(fù)雜生物樣品的檢測，具有高效、檢測模式多樣、分析速度快等優(yōu)點(diǎn);同時(shí)，本研究通過數(shù)據(jù)軟件處理，對生物樣品中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析鑒定，初步揭示了紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中的代謝途經(jīng)。

本研究以離體人腸道菌群為代謝模型，模擬并考察紅禾麻提取物在人腸道中的代謝過程。結(jié)果，共檢測到3個(gè)原型成分和22個(gè)代謝產(chǎn)物，主要為酚酸類和黃酮類化合物。其中，酚酸類成分的代謝途徑主要為單咖啡?；鼘幩岚l(fā)生還原、脫羥基還原、異構(gòu)化、甲基化等反應(yīng);黃酮類成分的代謝途徑主要為槲皮素發(fā)生羰基化、還原、甲基化、羥基化、去羥基化、O—C2鍵開環(huán)裂解，異槲皮苷發(fā)生甲基化，蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷發(fā)生脫糖，蘆丁發(fā)生羥基化，山柰酚-3-O-蕓香糖苷發(fā)生甲基化等反應(yīng)。本次試驗(yàn)在離體人腸道菌群反應(yīng)液中僅檢測到了3種原型成分，其余大部分均為代謝產(chǎn)物，說明紅禾麻提取物吸收進(jìn)入體內(nèi)可能會(huì)發(fā)生明顯的生物轉(zhuǎn)化過程。研究顯示，紅禾麻提取物中的單咖啡酰基奎寧酸（5-O-咖啡?；鼘幩?、3-O-咖啡酰基奎寧酸、4-O-咖啡?；鼘幩幔┖忘S酮類成分（蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷）很容易與腸道菌群中的酶類結(jié)合，發(fā)生水解、還原、異構(gòu)化等反應(yīng)[20-23]，與本試驗(yàn)結(jié)果相符合，推測該藥材提取物在體內(nèi)發(fā)揮藥效的活性成分除了原型成分外，還可能包括其代謝產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)的8個(gè)入血成分中，僅有木犀草苷既未檢測出原型，也未檢測出代謝產(chǎn)物，其原因可能是木犀草苷在腸道中代謝為與其他黃酮類成分代謝產(chǎn)物相同的成分而未能被區(qū)分;也有可能是由于本次采樣的紅禾麻藥材中木犀草苷含量較低，又或者被代謝成其他化合物后含量低于本試驗(yàn)分析方法檢測限而未能檢出。

綜上，紅禾麻提取物在離體人腸道菌群中代謝后的產(chǎn)物主要為3個(gè)原型產(chǎn)物（蘆丁、槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷）和22個(gè)代謝產(chǎn)物（主要為槲皮素、單咖啡?；鼘幩?、異槲皮苷等的代謝產(chǎn)物），其主要生物轉(zhuǎn)化途徑是以還原、氧化、水解為主的Ⅰ相反應(yīng)。本研究可為紅禾麻進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供參考。但由于本次試驗(yàn)是在離體人腸道菌群中進(jìn)行的代謝研究，無法全面反映紅禾麻中有效成分在體內(nèi)的代謝過程，因此后續(xù)還需通過分析血液、膽汁、尿液、糞便等樣品對紅禾麻有效成分在體內(nèi)的代謝過程進(jìn)行深入研究，并比較體內(nèi)外代謝產(chǎn)物的差異和相關(guān)性，進(jìn)一步為該藥材及其相關(guān)中藥復(fù)方的相互作用規(guī)律和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-02-01 修回日期：2020-05-28）

（編輯：段思怡）