1，25二羥維生素D3通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控自噬抑制足細胞凋亡

師 朗 張雅飛 方 旭 宋志霞,2

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的一種嚴重并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。有研究表明，足細胞損傷是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素[1-2]。有關(guān)足細胞損傷的機制尚未完全明確，仍缺乏有效的干預(yù)手段。因此，積極探尋高糖環(huán)境下足細胞的損傷機制，尋找特效治療方法顯得尤為重要。

自噬是真核細胞中普遍存在的細胞生物學(xué)過程。研究證實，一定水平的自噬對維持正常人足細胞的結(jié)構(gòu)、功能以及代謝穩(wěn)態(tài)有重要作用[3]。已有大量研究證實自噬異常與足細胞損傷密切相關(guān)。在阿霉素誘導(dǎo)的足細胞損傷模型中，自噬活化可以抑制足細胞的損傷，而在足細胞特異性敲除Atg7的小鼠足細胞損傷加重，該研究結(jié)果證實自噬在減輕足細胞損傷中發(fā)揮重要作用[4]，亦有研究在糖尿病腎病中模型中觀察到自噬活性能夠減輕糖尿病腎病尤其足細胞損傷[5-6]。這些研究結(jié)果提示足細胞自噬活性的失調(diào)可能是DN足細胞損傷的關(guān)鍵因素[5]。因此，尋找有效的調(diào)節(jié)足細胞自噬的藥物可能是防治DN足細胞損傷的關(guān)鍵。

活性維生素D3具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝以外的腎保護作用[7]。臨床研究結(jié)果提示，缺乏1，25(OH)2D3是影響2型糖尿病患者預(yù)后的獨立危險因素[8]。在1型及2型糖尿病動物模型也發(fā)現(xiàn)，維生素D干預(yù)可減少足細胞損傷，顯著降低蛋白尿[8-9]。我們及其他學(xué)者前期研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3可能通過上調(diào)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路，進而維持腎小球足細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[10-11]。本研究將進一步探討活性維生素 D3是否通過PI3K/Akt調(diào)控腎臟足細胞自噬和足細胞損傷。

材料與方法

材料和試劑小鼠永生系足細胞MPC-5由上海酶研科技有限公司提供。1，25(OH)2D3(羅蓋全)購于瑞士羅氏公司。

胎牛血清(北京百奧萊博科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；抗體LC3Ⅱ、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax和caspas-3(美國CST公司)；PI3K抑 制劑LY294002(賽默飛科技有限公司)；3-MA(美國Sigma-Aldrich公司)；胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、Triton X-100、DAPI(武漢碧云天生物公司)；羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)；細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)(上海尚寶生物科技有限公司)。

方法

足細胞培養(yǎng)和分組 將永生性小鼠足細胞系MPC-5在含有10% FBS和100 U/ml γ干擾素(IFN-γ)的PMI-1640培養(yǎng)基中在33℃，5%CO2條件下培養(yǎng)增殖，然后在37℃，5% CO2條件下在無IFN-γ的RPMI-1640中孵育14d，誘導(dǎo)細胞分化。實驗分組：(1)正常濃度葡萄糖(NG)組：葡萄糖 5 mmol/L；(2)高糖(HG)組：葡萄糖30 mmol/L；(3)甘露醇(NG+M)組：25 mmol/L甘露醇+葡萄糖5 mmol/L；(4)高糖+1，25(OH)2D3(HG+VD)組：葡萄糖 30 mmol/L+1，25(OH)2D3組[按照 1，25(OH)2D3濃度再分為1 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 組]；(5)高糖+1，25(OH)2D3+自噬抑制劑 3-甲基腺嘌呤(HG+VD+ 3-MA)組：葡萄糖30 mmol/L + 1，25(OH)2D3100 nmol/L + 3-MA 5 mmol/L；(6)高糖+1，25(OH)2D3+PI3K 抑制劑 LY294002(HG+VD+ LY294002)組：葡萄糖30 mmol/L + 1，25(OH)2D3100 nmol/L + LY294002 20 μmol/L。以上各組均培養(yǎng)72h，實驗至少重復(fù)3次。

Western印跡 MPC-5細胞在冷RIPA緩沖液中裂解，用10%SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)。再用含5%脫脂奶粉的PBS在4℃孵育3h，4℃與PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、caspas-3、Beclin-1和P62一抗孵育過夜，再與熒光標記的二抗在37℃孵育1h，化學(xué)發(fā)光法進行檢測并采用Image-Pro plus軟件(Media Controbernetics Inc，Rockville，MD)分析相關(guān)蛋白的表達，并以GAPDH作為內(nèi)參照。

CCK-8法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的MPC-5細胞，2×103個/皿接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，然后加入含不同濃度1，25(OH)2D3的培養(yǎng)基200 μl。1，25(OH)2D3的濃度分別1 nmol/L，50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，500 nmol/L；每組均設(shè)6個復(fù)孔，在1，25(OH)2D3加入72h后，于每個時間點每孔加入10 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h，用酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長檢測各孔吸光度(OD值)，細胞存活率=實驗組OD/對照組OD×100%。

免疫熒光觀察足細胞自噬情況 用30 mmol/L高糖誘導(dǎo)MPC-5細胞損傷，將損傷的細胞鋪在特定的培養(yǎng)皿中，用100 nmol/L的1，25(OH)2D3處理細胞72h，使用10%甲醛(北京化工廠)室溫固定細胞10 min，固定后用PBS洗3次，每次10 min。0.5%Triton X-100室溫透化5 min，PBS洗3次。封閉血清封閉30 min，去除非染色質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，10%血清室溫封閉1h，PBS洗3次。加LC3-Ⅱ一抗4℃過夜，PBS洗3次，每次10 min。滴加FITC標記山羊抗兔IgG熒光抗體避光孵育1h，PBS洗3次。用75%甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

統(tǒng)計學(xué)分析使用《GraphPad 8.0》軟件(美國加利福尼亞圣迭戈)進行統(tǒng)計分析。兩組之間的P值是使用Studentt檢驗計算的，三組以上的P值是通過單向方差分析(ANOVA)來計算的。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

高糖誘導(dǎo)MPC-5細胞凋亡通過CCK-8法檢測并計算MPC-5細胞存活率，其結(jié)果顯示，與NG組比較，NG+M組無明顯差異，但HG組細胞存活率下降(圖1A)。Western印跡結(jié)果顯示，與HG組相比，HG組細胞中Bcl-2蛋白表達水平下降、Bax和Caspase-3蛋白表達水平明顯升高(圖1B、C)。以上結(jié)果表明，高糖可誘導(dǎo)足細胞凋亡。

圖1 高糖干預(yù)足細胞72h對細胞存活率(CCK-8)、Bcl-2/Bax及Caspase-3表達的影響(Western 印跡)NG：正常對照組；NG+M：甘露醇滲透壓對照組；HG：高糖組；**P<0.01；n=3

1，25(OH)2D3減少高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡CCK-8檢測結(jié)果顯示，0～500 nmol/L 的1，25(OH)2D3對MPC-5細胞均無明顯毒性(ns)(圖2A)。不同濃度的1，25(OH)2D3可減輕高糖誘導(dǎo)的MPC-5細胞存活率下降，其中100 nmol/L的1，25(OH)2D3MPC-5對細胞存活率影響最大，且達到平臺期(圖2B)。故本研究選用100 nmol/L的1，25(OH)2D3為實驗濃度。Western 印跡檢測結(jié)果顯示，相對于HG組，HG+VD組MPC-5細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，凋亡蛋白Bax、caspase-3表達水平降低(圖2C、D)。上述結(jié)果提示，1，25(OH)2D3減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡。

圖2 1，25(OH)2D3 對高糖干預(yù)足細胞后72h細胞存活率(CCK-8)、BcL-2/Bax及Caspase-3表達的影響(Western 印跡)NG：正常對照組；HG：高糖組；HG+VD：高糖+1，25(OH)2D3；**P<0.01，*P<0.05；n=3

1，25(OH)2D3逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細胞自噬下調(diào)Western印跡結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組Beclin-1蛋白表達減少，P62蛋白表達明顯增多；與 HG組相比，HG+VD組細胞中Beclin-1蛋白表達增多，P62蛋白表達減少(圖3A、B)。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組LC3-Ⅱ蛋白表達減少；與 HG組相比，HG+VD組細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達增多(圖3C、D)。上述提示1，25(OH)2D3可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細胞自噬的下調(diào)。

3-MA阻斷活性維生素D對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的保護作用與NG組相比，HG組細胞nephrin、podocin表達減少，Desmin表達明顯增多；與HG組相比，HG+VD組細胞nephrin、podocin表達增加，desmin表達減少；與HG+VD組相比，HG+VD+3-MA組細胞nephrin、podocin表達減少，Desmin表達增多(圖4C、D)。上述提示3-MA阻斷了活性維生素D對高糖誘導(dǎo)的足細胞的損傷的保護作用。

1，25(OH)2D3對PI3K、Akt信號通路的影響與NG組相比，HG組細胞PI3K、p-AKT/t-AKT表達減少；與HG組相比，HG+VD組細胞PI3K表達增多、p-AKT/t-AKT表達增多(圖5)。上述提示1，25(OH)2D3通過PI3K/Akt信號通路發(fā)出信號。

圖3 1，25(OH)2D3 對高糖干預(yù)足細胞后Beclin-1、P62(Western 印跡)和LC3-Ⅱ(細胞免疫熒光)表達的影響NG：正常對照組；HG：高糖組；HG+VD：高糖+1，25(OH)2D3；**P<0.01，*P<0.05；n=3

圖4 3-MA對高糖+1，25(OH)2D3干預(yù)足細胞后nephrin、podocin及desmin 蛋白表達的影響(Western 印跡)NG：正常對照組；HG：高糖組；HG+VD：高糖+1，25(OH)2D3；HG+VD+3-MA：高糖+1，25(OH)2D3+3-甲基腺嘌呤；**P<0.01，*P<0.05；n=3

圖5 1，25(OH)2D3 對高糖干預(yù)足細胞后PI3K及p-AKT/t-AKT表達的影響(Western 印跡)NG：正常對照組；HG：高糖組；HG+VD：高糖+1，25(OH)2D3；**P<0.01，*P<0.05；n=3

LY294002阻斷1，25(OH)2D3對足細胞的保護和上調(diào)自噬的作用Western印跡結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組細胞nephrin、podocin表達減少，desmin表達明顯增多；與HG組相比，HG+VD組細胞nephrin、podocin表達增加，desmin表達減少；與HG+VD組相比，HG+VD+LY294002組細胞nephrin、podocin表達減少，desmin表達增多(圖6A、B)。上述提示LY294002阻斷了1，25(OH)2D3對高糖誘導(dǎo)的足細胞的損傷的保護作用。另外，與NG組相比，HG組Beclin-1蛋白表達減少，P62蛋白表達明顯增多；與 HG組相比，HG+VD組細胞Beclin-1蛋白表達增多，P62蛋白表達減少。與HG+VD組相比，HG+VD+LY294002組細胞Beclin-1蛋白表達減少，P62蛋白表達增多(圖6C、D)。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組LC3-Ⅱ蛋白表達減少；與HG組相比，HG+VD組細胞LC3-Ⅱ蛋白表達增多。與HG+VD組相比，HG+VD+LY294002組細胞LC3-Ⅱ蛋白表達減少(圖6E、F)。上述提示LY294002阻斷了活性維生素對上調(diào)自噬的作用。

圖6 LY294002對高糖+1，25(OH)2D3干預(yù)足細胞后nephrin、podocin、Beclin-1及P62蛋白表達(Western 印跡)和LC3-Ⅱ(細胞免疫熒光)表達的影響NG：正常對照組；HG：高糖組；HG+VD：高糖+1，25(OH)2D3；HG+VD+LY294002：高糖+1，25(OH)2D3+LY294002；**P<0.01，*P<0.05；n=3

討 論

DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，可引起腎小球濾過率(GFR)的進行性下降，最終進展至終末期腎病[12]。目前，臨床上常通過控制血糖及使用ACEI和ARB改善腎功能等治療手段，但仍不能完全有效地阻斷終末期腎病的進展。因此，積極尋求新的、安全的治療方法來進一步延緩DN的發(fā)展勢在必行。

DN進展的主要標志是蛋白尿和GFR降低，其腎臟損害是由于腎小球濾過屏障在高度分化的足細胞水平上的損害所致[13]。足細胞在DN的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[1-2]。有研究證實DN早期足細胞凋亡在其數(shù)量減少過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究顯示，高糖環(huán)境可引起足細胞凋亡明顯增加，這與既往研究結(jié)果一致[15]。

細胞自噬也稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是一種復(fù)雜的生理調(diào)控機制，其功能的行使受一系列相關(guān)基因產(chǎn)物的精密調(diào)節(jié)[16]。在糖代謝紊亂的代謝應(yīng)激狀態(tài)下，細胞主要依靠線粒體氧化脂肪酸和氨基酸作為主要能量來源，從而產(chǎn)生危險的活性氧，脂質(zhì)和葡萄糖代謝的變化導(dǎo)致氨基酸缺乏進而影響自噬[17]。自噬作為一種保守的細胞內(nèi)分解代謝途徑，在足細胞對抗細胞損傷和維護自身結(jié)構(gòu)和功能完整性的過程中發(fā)揮著重要作用[10]。有研究證實，足細胞可表現(xiàn)出很高的基礎(chǔ)自噬活性，通過降解晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)來抑制炎癥[18]。同時足細胞自噬活性的降低是DN足細胞損傷的關(guān)鍵因素[4-5]。本研究結(jié)果顯示，足細胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)72h后足細胞自噬活性下降。由此可見自噬作為對抗足細胞損傷的主要保護機制的重要性，自噬活性增強對腎小球疾病具有一定的細胞保護作用。自噬活性降低增加了DN的易感性。

對糖尿病人群的進一步調(diào)查表明，維生素D缺乏癥與DN之間存在獨立的聯(lián)系[19]，其中一個大型隊列研究AusDiab顯示維生素D缺乏與eGFR受損之間存在顯著相關(guān)性[20]。另外，發(fā)現(xiàn)維生素D及其類似物在臨床的治療中可使患者腎功能改善，尿白蛋白肌酐比率(UACR)降低，eGFR得以改善[21]。表明維生素D在延緩慢性腎臟病進程中可能發(fā)揮作用。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，1，25(OH)2D3相關(guān)受體能夠?qū)π募∪毖俟嘧p傷小鼠模型心肌有保護作用，其機制是通過抑制心肌細胞凋亡和調(diào)節(jié)自噬實現(xiàn)的。我們課題組前期也發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可通過上調(diào)維生素D3受體(VDR)水平增強自噬活性[6]。上述研究表明，1，25(OH)2D3對于細胞凋亡及自噬功能的維持具有重要作用。本研究證實，活性維生素D可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細胞自噬的下調(diào)，自噬抑制劑3-MA可阻斷活性維生素D對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的保護作用。

多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與足細胞自噬的調(diào)節(jié)，目前已有研究發(fā)現(xiàn)自噬的發(fā)生主要受到雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(P13KC1)-蛋白激酶B(PKB)和PI3KC3等途徑的調(diào)控[16]。mTOR是自噬的負性調(diào)控因子。高遷移率族蛋白1可通過抑制Akt/mTOR通路，減少足細胞自噬[23]。另外有研究表明影響PI3K/Akt信號通路可保護腎小球足細胞并改善蛋白尿[10,24]。目前有研究發(fā)現(xiàn)胰島素、胰島素樣生長因子等與受體結(jié)合后可通過活化PI3K/Akt及其下游的復(fù)合物，抑制mTOR的激酶活性，對自噬發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[24-25]。我們在實驗中觀察到，1，25(OH)2D3處理后，PI3K、p-Akt被激活，1，25(OH)2D3可通過MPC-5細胞的PI3K/Akt軸傳遞信號。通過LY294002阻斷PI3K /Akt信號通路，減弱1，25(OH)2D3對足細胞的保護作用及上調(diào)自噬的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3可誘導(dǎo)足細胞自噬，抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷和凋亡，進而保護腎臟損傷，這一過程是可能通過PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。本研究為活性維生素D治療DN提供了證據(jù)，但其療效機制及安全性仍需更多的研究證實。