隱匿性乙型肝炎病毒感染血液透析患者的分子特性及轉(zhuǎn)歸

鄧中鳳 陳 萍 鄒 楊

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球關注的健康問題。中國是慢性乙型病毒性肝炎的高發(fā)國家，2012年我國流行病學調(diào)查顯示，全國HBV 表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)陽性攜帶率為7.18%[1]。我國16個省市血液透析(hemodialysis,HD)患者的HBV感染率波動于6.3%～30.8%[2]。四川省HD患者的HBV感染率為11.09%，而本HD中心HBV感染率為7.3%[3]。

值得注意的是，HBV感染有多種臨床表現(xiàn)，除表現(xiàn)為慢性乙型病毒性肝炎，還可表現(xiàn)為隱匿性HBV感染(occult HBV infection,OBI)。此定義最早于2008年由歐洲肝病研究協(xié)會工作組提出[4]，定義為在患者血液中未檢出HBsAg，但在患者血液和(或)肝臟組織中檢測出HBV-DNA，病毒量低于200 IU/ml[4-5]。維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者由于其免疫功能低下、反復輸血、共享透析設備、反復血管穿刺及對疫苗反應低下等原因成為OBI高危人群[2-3]。全球HD患者OBI 發(fā)生率為0～58%不等[6]。據(jù)報道HBV基因型可分為10個基因型(A-J)，不同的基因型，其結(jié)局不同，其中B基因型最易在HD環(huán)境中傳播[7]。在我國鮮有MHD 患者OBI的相關報道，我們既往研究顯示本HD中心OBI的患病率為2.2%(7/315)，HBV-DNA病毒量很低(<20 IU/ml)[3]。但需警惕的是OBI患者雖然病毒量低，但其持續(xù)存在仍有進展為肝臟疾病的高風險[6]。目前關于OBI 的發(fā)病機制尚不明確，一些研究認為OBI 可能與宿主和病毒等多方面因素有關，大多數(shù)情況可能是繼發(fā)于明顯的HBV感染后，由于宿主強大的免疫應答導致殘存了很低水平的病毒血癥的表現(xiàn)[7]。另一個可能的機制是HBsAg的“a”抗原決定簇突變導致抗原識別逃逸，無法被目前的HBsAg檢測方法檢測到，而這可能是 OBI 的主要原因[6]。

既往我們報道了本中心有7例MHD患者確診為OBI[3]，本研究繼續(xù)關注該7例患者為期2年隨訪期間HBV-DNA轉(zhuǎn)歸、HBV基因型及突變情況。

對象和方法

研究對象四川省人民醫(yī)院HD中心的7例MHD合并OBI患者，均在陰性區(qū)接受血液透析治療。

研究方法

一般資料收集 包括患者的性別、年齡、透析齡、原發(fā)疾病、移植病史、輸血史、乙型肝炎疫苗接種史等信息。

血清標本收集 采取MHD合并OBI患者透析前靜脈血5 ml(使用BD SST 血清分離膠管)，予3 000 r/min離心5 min后分離血清，置于-80℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

乙肝標記物篩查(ELISA) 取MHD合并OBI患者透析前靜脈血5 ml送檢，采用蘇州新波生物技術(shù)有限公司HBV核心抗體(HBcAb)診斷試劑盒進行HBV標志物篩查(HBsAg、HBsAb、HBcAb)。

實時定量熒光PCR(real-time PCR) 對MHD合并OBI患者的血清樣品利用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test試劑盒(檢測最低閾值為20 IU/ml)進行HBV-DNA定量檢測(根據(jù)操作手冊進行)。

HBV S區(qū)域測序分析 (1)HBV-DNA的提取：血清樣本200 μl，利用Pure link Viral DNA mini kit(Thermo fisher，USA)試劑盒提取HBV DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)S基因擴增采用巢式PCR[Prime STAR Max DNA Polymerase(R045A,Takara,Japan)]對HBV的S區(qū)域進行擴增。引物參考序列AF2865942設計，目標是整個表面開放閱讀框[surface open reading frame(S ORF)][8](表1)。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定。(3)擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司公司進行雙向測序，S基因序列結(jié)果導入NCBI的在線基因分型工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)進行比對獲得 HBV基因型。(4)將所得S基因區(qū)的“a”抗原決定簇(氨基酸124～147或149)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中HBV B基因型參考株的序列進行比對分析氨基酸替換突變。

表1 S序列擴增所用引物

結(jié) 果

MHD合并OBI患者的轉(zhuǎn)歸7例MHD合并OBI患者均為男性，均無腎移植病史和乙肝疫苗接種史。5例為HBsAg-/HBsAb+/HBcAb+，即存在HBsAb+；2例為HBsAg-/HBsAb-/HBcAb+，即單獨HBcAb+。為期2年的隨訪期間，2例HBsAg-/HBsAb+/HBcAb+患者死亡，其余5例患者HBV血清學標記物無變化(表2)。

利用Real-time PCR對5例OBI患者進行HBV-DNA檢測。 3例HBsAg-/HBsAb+/HBcAb+患者(1、5、7號)未再檢出HBV-DNA(均未接受抗乙型肝炎病毒藥物治療)，2例單獨HBcAb+患者(2號和6號)則仍檢出HBV-DNA+(<20IU/ml)，提示單獨HBcAb+患者的HBV-DNA呈持續(xù)陽性(表2)。

表2 7例MHD合并OBI患者的特征

HBV基因型將5例MHD合并OBI患者的血液樣本進行巢式PCR，可見2號及6號患者(即單獨HBcAb+)能成功擴增出HBV S區(qū)域條帶(1 378 bp)(圖1)，與上述real-time PCR結(jié)果一致。并將其S基因序列結(jié)果導入NCBI在線基因分型工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)進行比對發(fā)現(xiàn)HBV的基因型為B型。

圖1 巢式PCR產(chǎn)物電泳圖1，2，5，6，7分別代表5例MHD合并OBI的患者，8為陽性對照，M為DNA marker

HBV突變情況由巢式PCR擴增出的產(chǎn)物是HBV的S區(qū)域(1 378 bp)，但只有1 203 bp是編碼區(qū)域，即preS1(119氨基酸)+preS2(55氨基酸)+S(227氨基酸)。結(jié)合HBsAg的“a”抗原決定簇的突變是已知的一種產(chǎn)生OBI的重要機制。因此對2號及6號患者的氨基酸序列與B型HBV的S區(qū)域的“a”抗原決定簇進行比對發(fā)現(xiàn)：2號患者的“a”抗原決定簇的氨基酸序列沒有突變， 6號患者的“a”決定簇中存在4個突變：Q129R(129位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?，T131N(131位的蘇氨酸突變?yōu)樘於０?，M133S(133位的甲硫氨酸突變?yōu)榻z氨酸)，F(xiàn)134L(134位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，D144E(144位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?(圖2)。

圖2 MHD合并OBI患者的“a”決定簇突變情況MHD:維持性血液透析；OBI：隱匿性乙型肝炎病毒感染；在“a”抗原決定簇區(qū)域，2號患者未發(fā)現(xiàn)突變，*代表6號患者突變的位置分別為Q129R、T131N，M133S，F(xiàn)134L和D144E

討 論

OBI是HBV感染的一種臨床表現(xiàn)，其可表現(xiàn)為2種形式：即血清學陽性和血清學陰性OBI。對于血清學陽性OBI患者，除了能檢測到血HBV-DNA存在，還可檢測到HBcAb/HBsAb陽性或單獨HBcAb陽性。而血清學陰性OBI即只能在血液或肝臟組織中檢測到HBV-DNA的存在，而HBcAb/HBsAb均陰性[5]。一般來說，近20% OBI患者為血清學陰性，80%OBI患者為血清學陽性[9]。本研究的7例MHD合并OBI患者均為血清學陽性，即100%血清反應陽性OBI，這與既往報道的OBI更流行于血清學陽性患者的結(jié)論一致[9]。

本研究顯示2年后3例HBsAg-/HBsAb+/HBcAb+患者HBV-DNA出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰，而2例單獨HBcAb+患者的HBV-DNA呈持續(xù)陽性，這推測可能與HBcAb為對HBV感染反應的第一個抗體，系非保護性抗體，故不能中和HBV病毒或抑制其復制，而HBsAb為感染或注射疫苗后產(chǎn)生的保護性抗體，能有效中和HBV顆粒，使其失去感染能力，產(chǎn)生免疫保護相關[9]。雖然2例單獨HBcAb+OBI患者雖能檢出HBV-DNA，但病毒量很低，均<20 IU/ml，這與既往文獻報道超過90%的OBI患者血中病毒量在20 IU/ml左右的結(jié)論一致[5]。

盡管OBI患者的HBV-DNA病毒量很低，但據(jù)報道其持續(xù)存在仍有進展為肝臟疾病的高風險，可通過透析、輸血、器官移植等途徑傳染給其他患者，可致爆發(fā)性肝炎、肝癌等的發(fā)生[6]，不同HBV的基因型其結(jié)局不同。HBV的基因型即HBV核苷酸序列的差異，根據(jù)HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%可定為不同的基因型，共10種基因型(A-J)。西方國家最常見的是A和D型，而在亞洲地區(qū)包括中國最常見的是B和C型[6]。在中國普通人群中的OBI的基因型常見的也是B和C型，且基因B型更易在HD環(huán)境中傳播[7]。本中心2例MHD合并OBI患者的基因型亦為B型，這與既往報道結(jié)論相一致[6]。

目前關于OBI的發(fā)生機制仍不甚明了，認為HBsAg的“a”決定簇的突變是已知的一種產(chǎn)生OBI的重要機制[5]。HBsAg由S基因編碼，S區(qū)域主要可以分為N端(氨基酸1～99)，主要親水區(qū)域(major hydrophilic region,MHR，氨基酸100～169)及C段(氨基酸170～226)。MHR里的“a”抗原決定簇(氨基酸124～147或149)，可維持HBsAg的抗原性，是HBsAg被HBsAb及免疫細胞識別的主要靶位，所以這個區(qū)域的突變往往會帶來蛋白結(jié)構(gòu)的改變，導致免疫逃逸和持續(xù)感染的存在，往往也導致商業(yè)化的HBsAg試劑盒不能檢測到HBsAg，從而產(chǎn)生OBI[7,10]。目前全世界相繼報道顯示OBI患者 “a”抗原決定簇存在G145R/A/I/W/E、L109R、G119R、 P120T、K122I，T126N、T127R、E129N、T131N、M133T/L、F134L、C139S、T140L、D144E和P153L等突變[10-16]，這些突變會導致表面抗原產(chǎn)生的不同和逃逸。Koyanagi等[11]報道G145A 和 E129N突變引起該位點的糖基化，從而影響HBsAg的抗原性。K122I突變可以損害HBsAg的分泌和抗體的結(jié)合及免疫逃逸[12]。Nainan等[13]等報道T127R突變?yōu)樘右萃蛔?；Mu等[14]報道C139S突變，可導致HBV疫苗無效。本研究中，6號MHD合并OBI患者的“a”決定簇存在Q129R、T131N、M133S、F134L、D144E突變，結(jié)合既往已有相關研究報道顯示T131N,F134L及D144E的突變均已有報道[12,15-16]，但目前還沒有Q129R與M133S突變的相關報道，因此，這是首次發(fā)現(xiàn)OBI患者的Q129R及M133S突變。

綜上，本中心MHD的OBI患者以血清學陽性為主，主要是HBV的B型，且首次發(fā)現(xiàn)“a”抗原決定簇發(fā)生的Q129R及M133S的突變。單獨HBcAb+者的HBV-DNA可呈持續(xù)陽性，因此，警示我們務必重視對MHD患者單獨HBcAb+患者的HBV-DNA的篩查。