長(zhǎng)鏈非編碼RNA FEZF1-AS1在喉癌中的表達(dá)及意義*

曲丹菊, 張超, 蘇吉利

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院(河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)耳鼻咽喉科(河南洛陽(yáng) 471000)

喉癌(laryngeal cancer，LC)是臨床上頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，占全身腫瘤的2.1%，喉癌原發(fā)部位可以分為：聲門型、聲門上型、聲門下型，其中以聲門型占60%[1-2]。喉癌，大約98%為鱗狀細(xì)胞癌，其他腺癌、惡性淋巴瘤、基底細(xì)胞癌、淋巴肉瘤等臨床上少見(jiàn)。早期喉癌患者，術(shù)后多能保留發(fā)聲和吞咽功能，但喉癌臨床表現(xiàn)具有隱蔽性，導(dǎo)致大部分患者發(fā)現(xiàn)病情時(shí)，喉癌已處于中晚期，中晚期患者治療多采用全喉切除加放療，患者術(shù)后發(fā)音、呼吸及進(jìn)食功能皆受到嚴(yán)重影響[3-4]。目前喉癌具體病因尚不清楚，可能與環(huán)境因素、吸煙、飲酒等不良生活等相關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Lnc RNA在癌癥中作用越來(lái)越被重視，Lnc RNA具有很多生物學(xué)功能。Lnc RNA FEZ家族鋅指1反義RNA(Lnc RNA FEZF1-AS1)是新發(fā)現(xiàn)的Lnc RNA，F(xiàn)EZF1-AS1也與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1能夠促進(jìn)大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[5]。也有報(bào)道顯示[6]FEZF1-AS1在胰腺癌、大腸癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。但FEZF1-AS1如何影響喉癌目前尚少有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用實(shí)時(shí)定量法測(cè)定喉癌組織中FEZF1-AS1水平，并分析與喉癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年1月至2018年1月術(shù)前未經(jīng)治療的喉癌患者78例組織標(biāo)本，其中男65例，女13例，年齡36～72歲，平均(54.28±13.42)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)病理診斷確診為喉癌；(2)患者臨床資料完整，能夠接受術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)其他惡性腫瘤患者；(2)具有精神異?；颊?；(3)因經(jīng)濟(jì)等原因，停止后續(xù)治療患者。同期取喉癌旁正常黏膜組織78例作為對(duì)照組。將標(biāo)本分為兩部分，一部分液氮冷凍后，保存于-80℃冰箱，一部分標(biāo)本置于10%中性甲醛固定24 h，將組織取出、石蠟包埋，然后用蘇木精-伊紅染色。所有標(biāo)本送于病理科，均由兩位副主任醫(yī)生確定喉癌組織為鱗狀細(xì)胞癌，喉癌旁黏膜組織為正常組織。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(DP431)，天根生化科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR? Green Quantitative RT-qPCR Kit(QR0100)，日本TaKaRa生物公司；C1000 TouchTMPCR儀、CFX96熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 臨床資料收集 根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)協(xié)會(huì)關(guān)于喉癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(2002)確定。原發(fā)部位：聲門上型24例，聲門型42例，聲門下型12例；臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期28例，Ⅳ期20例；病理學(xué)分級(jí)：鱗狀細(xì)胞癌G1級(jí)40例，G2級(jí)26例，G3級(jí)12例；病理證實(shí)頸部有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移組54例，無(wú)轉(zhuǎn)移組24例。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)FEZF1-AS1表達(dá)水平 從超低溫冰箱取出喉癌患者癌癥組織及癌旁組織樣品，在液氮中研磨，RNA提取試劑盒按照操作步驟提取總RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄得cDNA。用qRT-PCR儀檢測(cè)FEZF1-AS1表達(dá)水平，分別采用內(nèi)參和FEZF1-AS1引物，以cDNA模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)檢測(cè)樣本的內(nèi)參基因和FEZF1-AS1的值，取3次結(jié)果的平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，qRT-PCR程序設(shè)定為94℃預(yù)熱3 min，94℃ 30 s，56℃ 35 s，72℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。總反應(yīng)體系(20.0 μL)：2×SYBR Green Taq Ready Mix, 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。引物由上海生工合成。引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 隨訪 隨訪時(shí)間為3～36個(gè)月，隨訪截止時(shí)間為2019年1月，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時(shí)間，隨訪方式為入戶、電話隨訪，門診檢查，隨訪內(nèi)容為患者生存情況等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，行2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間行LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FEZF1-AS1在喉癌組織和喉癌旁黏膜組織表達(dá)水平 與喉癌旁黏膜組織相比，喉癌組織FEZF1-AS1表達(dá)水平較高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 FEZF1 － AS1 在喉癌組織和喉癌旁黏膜組織表達(dá)水平

2.2 FEZF1-AS1表達(dá)水平與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以FEZF1-AS1表達(dá)水平平均數(shù)為界，將喉癌患者分為高表達(dá)組60例和低表達(dá)組18例。分析顯示，F(xiàn)EZF1-AS1表達(dá)水平與性別、年齡、喉癌原發(fā)部位、病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)，與臨床分期、T分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 FEZF1-AS1表達(dá)水平與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.3 FEZF1-AS1表達(dá)水平與喉癌患者生存率的關(guān)系 FEZF1-AS1高表達(dá)喉癌患者中位生存時(shí)間為13.60個(gè)月，顯著短于FEZF1-AS1低表達(dá)患者中位生存時(shí)間(23.44個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.4 影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 單因素分析表明，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分級(jí)T3～T4期及FEZF1-AS1高表達(dá)是喉癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FEZF1-AS1高表達(dá)是喉癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=1.589，95%CI為1.362～1.854；HR=2.375，95%CI為1.367～4.127，P<0.05)，見(jiàn)表4。

3 討論

喉癌是相對(duì)侵襲較高的惡性腫瘤，占每年新發(fā)腫瘤的2.4%[7]。喉癌在臨床上主要表現(xiàn)為喉鱗狀細(xì)胞癌[8]。目前，盡管醫(yī)學(xué)水平不斷提高，但晚期喉癌患者術(shù)后生存率仍然較低，因此，喉癌的早期診斷顯得尤為重要[9]。為提高喉癌患者預(yù)后生活質(zhì)量，尋找新型預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)迫在眉睫。

FEZF1-AS1位于染色體7號(hào)上，長(zhǎng)度為大約為2 653 bp，基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，它包含3個(gè)剪接變體和7個(gè)外顯子。Chen等[5]首先報(bào)道FEZF1-AS1在人原發(fā)性大腸癌中上調(diào)，并與大腸癌轉(zhuǎn)移和

圖1 FEZF1-AS1表達(dá)水平與喉癌患者生存率的關(guān)系

表4 COX回歸分析影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

不良預(yù)后有關(guān)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1表達(dá)影響大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移。Cheng[10]通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR證實(shí)，F(xiàn)EZF1-AS1在鼻咽癌組織中表達(dá)水平顯著增加，與鼻咽癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲除FEZF1-AS1基因，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯在G0/G1期。食管癌是全球范圍內(nèi)具有高發(fā)病率，高病死率的致死性癌癥之一。Yang等[11]在食管癌研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著上調(diào)，F(xiàn)EZF1-AS1低表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)則加速食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，F(xiàn)EZF1-AS1可能影響肺腺癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1表達(dá)水平在喉癌組織中顯著高于正常喉癌旁黏膜組織，說(shuō)明FEZF1-AS1在喉癌組織表達(dá)水平上調(diào)，提示FEZF1-AS1可能參與喉癌的發(fā)生。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1高表達(dá)與宮頸癌組織學(xué)分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、臨床分化顯著相關(guān)。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1表達(dá)水平與喉鱗狀細(xì)胞癌患者臨床分期、T分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示喉癌病情發(fā)展可能與FEZF1-AS1表達(dá)水平變化密切相關(guān)，F(xiàn)EZF1-AS1在喉癌中可能發(fā)揮重要作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)EZF1-AS1與肺腺癌、大腸癌、肺鱗狀細(xì)胞癌[14]、胰腺導(dǎo)管腺癌[15]等腫瘤的生長(zhǎng)及預(yù)后顯著相關(guān)，可作為預(yù)后的臨床指標(biāo)。Ye等[15]在胰腺導(dǎo)管腺癌研究中發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1高表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌術(shù)后生存率相關(guān)，是影響腫瘤患者病死率的重要因素。Zhang等[13]研究宮頸癌預(yù)后不良與FEZF1-AS1關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1表達(dá)水平是宮頸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)喉癌患者中位生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)腫瘤患者中位生存時(shí)間，提示FEZF1-AS1高表達(dá)喉癌患者預(yù)后較差。COX多因素分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FEZF1-AS1高表達(dá)是喉癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示FEZF1-AS1有可能成為預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物之一，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)喉癌患者應(yīng)做好術(shù)后復(fù)查。

綜上所述，F(xiàn)EZF1-AS1在喉癌組織表達(dá)水平上調(diào)，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)是喉癌患者預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素，F(xiàn)EZF1-AS1有可能成為預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物之一，為我們治療喉癌提供新視野。但FEZF1-AS1與喉癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有待進(jìn)一步研究。