布地奈德聯(lián)合孟魯司特治療小兒哮喘對抗凝血酶Ⅲ、CD5抗原蛋白和NLRP3炎癥小體的影響*

高偉霞， 秦小菀， 劉陽， 丁顯春， 朱永杰

南陽市中心醫(yī)院 1急診兒科, 2兒科一病區(qū), 3兒科三病區(qū)(河南南陽 473009)； 2鄭州兒童醫(yī)院急診科(河南鄭州 450053)

哮喘是常見的慢性呼吸道疾病，對兒童的健康和生活質(zhì)量有很大的影響[1]。全球哮喘患者多達(dá)3億左右，且有逐年增高的趨勢[2-4]。哮喘主要由中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞及組分參與的異質(zhì)性氣道疾病，臨床主要表現(xiàn)為過敏性喘息，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，誘因多且與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)[5-6]。炎癥小體是機(jī)體內(nèi)多種蛋白在內(nèi)外刺激下形成的復(fù)合體，可通過調(diào)控促炎因子的釋放對內(nèi)外因子產(chǎn)生應(yīng)答，參與哮喘的發(fā)病過程[7-8]。目前，吸入糖皮質(zhì)激素是治療兒童哮喘的首選藥物，抗膽堿能藥物、白三烯受體拮抗劑和β2 受體激動劑為治療兒童哮喘的常用藥，且常聯(lián)合使用[9]。本研究探討布地奈德聯(lián)合孟魯司特治療小兒哮喘的療效和對血清抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、CD5抗原樣蛋白(CD5L)和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白3(NLRP3)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年2月至2018年2月在我院接受哮喘治療的患兒124例，男56例，女68例，年齡1.5～10歲，平均(5.7±3.6)歲，病程0.8～3.2年。輕度哮喘54例，中度哮喘45例，重度哮喘25例，選中患者均符合哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除活動性肺結(jié)核、其他呼吸道疾病、近2周有呼吸道感染的患兒。分為布地奈德組(A組)51例患兒，男23例，女28例，年齡(4.7±3.0)歲，病程(1.8±0.45)年，輕度哮喘17例，中度哮喘25例，重度哮喘9例。布地奈德聯(lián)合孟魯司特組(B組)73例患兒，男33例，女40例，年齡(5.1±3.2)歲，病程(2.1±0.56)年，輕度哮喘37例，中度哮喘20例，重度哮喘16例。兩組患兒的性別、年齡、病程和哮喘分型均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。按年齡、性別匹配選取同一時期體檢的健康兒童40例作為對照組(C組)。本研究受醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患兒入院以后均給予常規(guī)的化痰、吸氧和抗感染等治療。A組：霧化吸入布地奈德(信宜藥業(yè)有限公司 國藥準(zhǔn)字 H20161002)2 mL/次，吸入10～15 min/次，2 次/d。B組：霧化吸入布地奈德方法同上，2歲以下患兒睡前口服孟魯斯特(國藥準(zhǔn)字 J20130047；杭州默沙東制藥有限公司)4 mg/d，>5 歲患兒 5 mg/d，治療3個月。治療前后均檢測1 s用力呼氣容積(FEV1)、峰流速(PEF)，觀察患兒用藥后是否有不良反應(yīng)。

1.3 qRT-PCR實驗 檢測研究對象外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平。利用人淋巴細(xì)胞分離液(上海索寶生物科技公司)分離外周血單個核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，利用Trizol總RNA 提取試劑盒(美國Invitrogen 公司)提取總RNA,紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度，吸光度A260值/A280值在1.80～2.20之間為合格品。以cDNA為模板，按照試劑盒說明對引物進(jìn)行擴(kuò)增，NLRP3上游引物 5′-GCTGGTCTTGAATTCCTCA-3′，下游引物5′-GGCACACGGATGAGTCTTT-3′，β-actin上游引物5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，下游引物5′-CGTACAGGTCTTTGC GGATG-3′，引物序列由上海生工生物公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)條件：92℃ 5 min,92℃ 30 s，56℃ 60 s，70℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個樣品設(shè)6個平行復(fù)孔。按照公式RQ=2-ΔΔCT計算外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 mRNA 表達(dá)水平。

1.4 ELISA實驗 采集研究對象治療前晨起空腹肘靜脈血10 mL，分裝于抗凝管中，以2 500 r/min的速度離心15 min，留取血清，放置-70℃冰箱中保存待用。AT-Ⅲ和CD5L酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于上海研域化學(xué)試劑有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行檢測，每次均使用廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。

1.5 療效評定標(biāo)準(zhǔn) 顯著有效：肺功能回復(fù)正常，咳嗽、氣喘、憋喘、啰音等臨床癥狀消失；有效：肺功能有所改善，咳嗽、氣喘、憋喘、啰音等臨床癥狀緩解，F(xiàn)EV1增加≥20%；無效：肺功能無明顯改善，咳嗽、氣喘、憋喘、啰音等臨床癥狀緩解不明顯。

2 結(jié)果

2.1 肺功能檢測結(jié)果的比較 治療前，A組、B組與C組相比，F(xiàn)EV1和PEF水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；治療前A組與B組相比，F(xiàn)EV1和PEF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，A組和B組FEV1和PEF的水平均明顯高于治療前(P<0.01)；A、B兩組間FEV1和PEF差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療前后肺功能檢測結(jié)果比較

2.2 兩組患兒治療后的臨床療效比較 B組總有效率90.4%，顯著高于A組的84.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=7.18，P=0.028)。見表2。

表2 兩組患兒治療后的的臨床療效比較 例(%)

2.3 AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3檢測結(jié)果比較 治療前，A組和B組AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3 mRNA的水平無明顯差異(P>0.05)，但與C組比較，AT-Ⅲ和NLRP3的水平升高，CD5L的水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后，B組AT-Ⅲ的水平明顯低于A組(P<0.001)，而B組和A組CD5L和NLRP3 mRNA的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A組治療后與治療前相比，AT-Ⅲ和CD5L的水平無明顯改變(t=0.48、1.52,P=0.638、0.150)，NLRP3 mRNA的水平在治療后明顯降低(t=10.28、P=0.000)；B組治療后與治療前相比，AT-Ⅲ和NLRP3 mRNA的水平降低，CD5L的水平升高(t=5.35、11.10、2.32,P=0.000、0.000、0.034)。見表3。

表3 治療前后AT －Ⅲ、CD5L 和NLRP3 檢測結(jié)果比較

3 討論

支氣管哮喘是一種全球性的慢性氣道持續(xù)性炎癥疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告，中國支氣管哮喘患者人數(shù)高達(dá)3 000萬，且呈逐年上升趨勢[10]。嬰幼兒哮喘多數(shù)在上呼吸道病毒感染后誘發(fā)，起病較緩慢，而兒童哮喘多由吸入變應(yīng)原誘發(fā)，起病較急[11-13]。支氣管哮喘以氣道高反應(yīng)性為主要臨床特征，其發(fā)病率受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[14]。研究報道，支氣管哮喘與氣道炎癥，過敏反應(yīng)以及神經(jīng)腫瘤和其他因素密切相關(guān)[15]。布地奈德是一種常見的糖皮質(zhì)激素藥物，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用。然而，長期使用會導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)和戒斷效應(yīng)[16]。孟魯司特是一種半胱氨酰白三烯(Cys-LT)受體的拮抗劑，可以調(diào)節(jié)白三烯途徑，臨床上用于哮喘的急性和長期治療，目前廣泛應(yīng)用于治療哮喘兒童[17]。布地奈德與孟魯司特的聯(lián)合使用可減少糖皮質(zhì)激素的用量，提高治療的效果。

兒童哮喘可誘發(fā)氣道損傷，增加氣道反應(yīng)性，主要以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥因子相關(guān)[18]。降低氣道的高反應(yīng)性是治療的關(guān)鍵，也是判斷是否有效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19]。本研究主要比較布地奈德單獨治療和布地奈德與孟魯司特聯(lián)合治療的療效和對患兒血清中AT-Ⅲ、CD5L和單個核細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平的影響。治療前，布地奈德單獨治療組和布地奈德與孟魯司特聯(lián)合治療組與C組相比，F(xiàn)EV1、PEF的水平明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，治療后FEV1、PEF的水平有顯著的提高。B組患兒的總有效率高達(dá)90.4%，明顯高于布地奈德單獨治療組84.3%，說明布地奈德聯(lián)合孟魯司特治療效果優(yōu)于布地奈德的單獨使用。目前，AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3為小兒哮喘中研究較多的生物標(biāo)記物[20-21]。AT-Ⅲ為肝臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞合成的一種糖蛋白,主要參與體內(nèi)凝血和抗凝過程,哮喘患兒體內(nèi)常呈慢性缺氧狀態(tài),可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,或?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,造成AT-Ⅲ大量釋放[22]。CD5L 與血清中的IgM 結(jié)合,是Th17 細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子,而Th17 細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞亞群,可維持組織穩(wěn)定性、參與抵抗外界抗原的入侵,對評估哮喘患者病情及預(yù)后有一定的意義[23]。NLRP3由含有CARD 結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和含半朧氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶相互作用組成，不僅在細(xì)菌等病原體導(dǎo)致的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，而且與非感染性炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[24-26]。治療前，布地奈德單獨治療組和布地奈德與孟魯司特聯(lián)合治療組與C組相比AT-Ⅲ和NLRP3的水平升高，CD5L的水平降低。經(jīng)過3個月的治療后布地奈德聯(lián)合孟魯司特AT-Ⅲ和NLRP3的水平降低，CD5L的水平升高，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。布地奈德單獨治療組AT-Ⅲ的水平降低，CD5L的水平升高但與治療前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而NLRP3的水平明顯降低與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，布地奈德與孟魯司特聯(lián)合使用治療小兒哮喘療效優(yōu)于布地奈德單獨治療，血清中AT-Ⅲ與CD5L的含量和NLRP3 mRNA的水平均有明顯改善。