鹽酸小檗堿對(duì)初發(fā)2型糖尿病患者降糖療效及腸道菌群的影響

朱英倩, 江 華, 沙雯君, 雷 濤

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200120；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200333)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病，我國(guó)T2DM患病人數(shù)居世界首位[1]。T2DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生發(fā)展可能與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[2]，腸道菌群參與機(jī)體代謝、免疫調(diào)節(jié)等重要功能[3]，而菌群失調(diào)時(shí)可能會(huì)引起代謝異常[4]，研究表明，T2DM患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)較健康對(duì)照組受試者存在差異[5],調(diào)節(jié)腸道菌群可能成為改善T2DM的新靶點(diǎn)。

小檗堿是一種從中藥黃連素中提取的生物堿。具有一定的降糖作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[6-7]?？诜￠迚A生物利用度極低[8]，推測(cè)小檗堿可能通過(guò)局部調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮作用。已有動(dòng)物研究表明，小檗堿能夠調(diào)節(jié)高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群紊亂、改善胰島素抵抗和肥胖癥狀[9-10]，但小檗堿臨床治療T2DM以及調(diào)節(jié)腸道菌群的證據(jù)還有待明確。此外，胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1, GLP-1)一種是由腸道L細(xì)胞分泌的胃腸激素，能夠減緩胃排空、促進(jìn)胰島素分泌，維持血糖穩(wěn)態(tài)[11]。研究表明，小檗堿可以升高GLP-1的表達(dá)水平、降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善胰島素抵抗和代謝紊亂[9,12]，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本研究以初發(fā)T2DM患者為研究對(duì)象，觀察鹽酸小檗堿的降糖療效以及對(duì)腸道菌群、GLP-1的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步分析小檗堿調(diào)節(jié)血糖的可能機(jī)制，為其在臨床的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入選受試者為2018年1月—2018年10月就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科初發(fā)T2DM患者，共50例。兩組受試者人口學(xué)基本信息比較見(jiàn)表1。兩組在性別、年齡、BMI、降糖藥物差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組受試者一般資料比較

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入病例符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)有T2DM典型癥狀，空腹血糖≥7.0mmol/L或2h血糖≥11.1mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L；(2)無(wú)T2DM典型癥狀，僅空腹血糖≥7.0mmol/L或2h血糖≥11.1mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L，需重復(fù)1次，血糖仍達(dá)以上標(biāo)準(zhǔn)者；(3)初發(fā)糖尿病患者(病程≤1年)；(4)年齡40～ 80歲；(5)受試者知情本研究，自愿簽署知情同意書(shū)；(6)服藥依從性好，能配合各項(xiàng)檢查。本研究已通過(guò)倫理委員會(huì)審查(PTEC-A-2017-14S-1)。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)1型糖尿病、妊娠糖尿病、其他特殊類(lèi)型糖尿??；(2)糖尿病疾病急性并發(fā)癥或急性期感染、血糖控制不穩(wěn)定期；(3)有嚴(yán)重全身性疾病，如腫瘤、自身免疫性疾?。?4)心腦血管疾病不穩(wěn)定期、肝腎等臟器嚴(yán)重?fù)p害；(5)近1個(gè)月內(nèi)服用抗菌素、益生菌或微生態(tài)活菌制劑等；(6)近1個(gè)月內(nèi)服用GLP-1受體激動(dòng)劑或二肽基肽酶抑制劑、二甲雙胍或阿卡波糖；(7)未使用胰島素治療；(8)胃腸手術(shù)史、腸易激綜合征或便秘病史；(9)精神病患者或妊娠。

1.3 研究方法

1.3.1 分組 本研究采用隨機(jī)、雙盲的研究方法。(1)隨機(jī)分組: 應(yīng)用Excel生成隨機(jī)數(shù)字，由計(jì)算機(jī)隨機(jī)將受試者按1∶1分配至小檗堿組和安慰劑組。受試者從1～50編號(hào),按就診先后順序分配盲號(hào)，該編號(hào)在整個(gè)研究過(guò)程中保持不變。盲號(hào)為本研究的盲底，予以密封，研究人員在干預(yù)結(jié)束前不得擅自拆封。(2)盲法: 本研究中受試者與研究人員均不了解分組情況。鹽酸小檗堿片由上海信誼天平藥業(yè)有限公司制造(批號(hào): H20034013)，安慰劑由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥劑科制備，其外形、顏色等均與鹽酸小檗堿匹配，封裝于包裝盒內(nèi)，由與研究過(guò)程無(wú)關(guān)的專(zhuān)人發(fā)放，研究人員與受試者均不知曉分配制劑的成分。

1.3.2 干預(yù)方法 兩組受試者均給予基礎(chǔ)治療，包括嚴(yán)格飲食控制、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)。小檗堿組: 在常規(guī)降糖方案基礎(chǔ)上，加用鹽酸小檗堿片。服用方法: 每次0.5g，每日3次，療程12周。安慰劑組: 在常規(guī)降糖方案基礎(chǔ)上，服用安慰劑。服用方法: 每次0.5g，每日3次，療程12周。

1.3.3 觀察指標(biāo) 小檗堿組和安慰劑組患者在0周、治療12周時(shí)分別采集清晨空腹靜脈血，留取清晨空腹糞便標(biāo)本置于一次性無(wú)菌糞便盒內(nèi)(1h內(nèi)完成送檢)；檢測(cè)糖尿病組和安慰劑組患者治療前后空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c, HbA1c)、空腹胰島素水平(fasting insulin, FINS)、GLP-1。兩組受試者入組期間,每周進(jìn)行電話隨訪，記錄患者服藥、飲食情況。在此期間患者服藥、運(yùn)動(dòng)、飲食習(xí)慣保持不變。

1.3.4 腸道菌群培養(yǎng) (1)收集受試者新鮮的自然排便1g左右置于密封的無(wú)菌便盒中，常溫下1h內(nèi)快速送檢；(2)取1g糞便，加入10mL試管中，無(wú)菌生理鹽水充分混勻稀釋至10mL；將混勻液依次稀釋為102～107的濃度梯度，分別用移液器依次吸取0.1mL均勻涂布至對(duì)應(yīng)的選擇培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋度平行接種3次；(3)采用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)菌落: 雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌先進(jìn)行厭氧處理，再放入37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)48h；腸桿菌、腸球菌采用需氧培養(yǎng)法，直接放在37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24h；(4)觀察結(jié)果: 根據(jù)培養(yǎng)基菌落數(shù)目，選擇30～300菌落(cfu)的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)；(5)細(xì) 菌數(shù)計(jì)算公式(cfu/g)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10；結(jié)果以每g糞便質(zhì)量中菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表示(log10cfu/g)。

1.3.5 GLP-1等血液指標(biāo)水平檢測(cè)方法 收集清晨空腹靜脈血5mL離心(離心半徑7cm，3000r/min，10min)，Elisa酶聯(lián)免疫法測(cè)定GLP-1水平。FBG采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，HbA1c采用高壓液相色譜法測(cè)定,FINS采用放射免疫法測(cè)定。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance, HOMA-IR)，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床指標(biāo)以及GLP-1水平比較

干預(yù)前兩組T2DM患者FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、GLP-1差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)12周后，小檗堿組FBG、HbA1c、HOMA-IR低于安慰劑組，GLP-1較安慰劑組升高(P<0.05)，兩組的FINS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)前后兩組受試者臨床指標(biāo)以及GLP-1水平變化

2.2 干預(yù)后兩組腸道菌群變化

干預(yù)前小檗堿組與安慰劑組受試者腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌、腸球菌變化差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)12周后小檗堿組的腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌較安慰劑組升高，腸球菌較安慰劑組下降(P<0.05)；擬桿菌、腸桿菌較安慰劑組顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 干預(yù)后兩組患者腸道菌群改變

2.3 腸道菌群數(shù)與血糖相關(guān)性分析

兩組T2DM患者干預(yù)前后FBG水平與雙歧桿菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.273，P=0.007)，與乳酸桿菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.225，P=0.027)，與腸桿菌數(shù)呈正相關(guān)(r=0.286，P=0.005)，與擬桿菌數(shù)及腸球菌數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 GLP-1變化差值與腸道菌群相關(guān)性分析

兩組T2DM患者干預(yù)前后GLP-1差值與雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、擬桿菌、腸球菌數(shù)變化差值均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。GLP-1前后差值與FBG、FINS、HOMA-IR前后差值無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，但與HbA1c變化差值相關(guān)(r=-0.377，P=0.008)。

2.5 干預(yù)12周的安全性評(píng)估

記錄受試者不良事件、生命體征、心電圖及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括肝腎功、血常規(guī)、尿常規(guī)等。整個(gè)研究過(guò)程中，兩組受試者無(wú)肝腎功能損傷，無(wú)惡心、腹脹及明顯便秘等不良事件報(bào)告，無(wú)過(guò)敏性反應(yīng)、皮疹、藥物熱等異常反應(yīng)，期間無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

3 討 論

當(dāng)前T2DM的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，增加了血糖控制以及糖尿病心腦并發(fā)癥一、二級(jí)預(yù)防的難度。近年來(lái)研究表明，腸道菌群在T2DM的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。T2DM患者較正常健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為產(chǎn)丁酸的乳酸桿菌等益生菌數(shù)量減少，而各種條件致病菌增多[14]。T2DM發(fā)生可能已經(jīng)出現(xiàn)腸道菌群改變[15]，調(diào)節(jié)腸道菌群可能是治療T2DM的靶點(diǎn)。已有研究表明多種降糖藥物可能通過(guò)作用腸道菌群發(fā)揮作用。二甲雙胍是目前T2DM治療的一線用藥，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道膽汁酸代謝及腸道菌群[16]，Meta分析表明二甲雙胍治療的T2DM患者腸道菌群構(gòu)成發(fā)生顯著變化[17]。此外，α-糖苷酶抑制劑、DDP-4抑制劑以及GLP-1受體激動(dòng)劑等降糖藥物可以改變腸道菌群[18-20]。但目前研究尚不支持磺脲類(lèi)以及噻唑烷二酮類(lèi)降糖藥物對(duì)腸道菌群的影響作用[21-22]。

鹽酸小檗堿是廣譜抗菌藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以有效降低血糖。但其生物利用度低，因此推測(cè)其降糖療效的機(jī)制之一可能是參與對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)。本研究考慮其他藥物也可能對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響，因此排除了服用二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑、GLP-1受體激動(dòng)劑以及DPP-4抑制劑的T2DM患者。初步發(fā)現(xiàn)，小檗堿組雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)較安慰劑組升高，而擬桿菌、腸桿菌、腸球菌數(shù)量下降，表明鹽酸小檗堿對(duì)腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究也發(fā)現(xiàn)FBG水平與腸道菌群數(shù)量具有一定的相關(guān)性，對(duì)整體FBG與腸道菌群數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，雙歧桿菌與乳酸桿菌與FBG呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是雙歧桿菌、乳酸桿菌可以升高腸道β半乳糖苷酶、葡萄糖苷水解酶的活性，促進(jìn)外周組織對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)有效吸收和利用。相關(guān)研究表明益生菌可促進(jìn)多糖轉(zhuǎn)化為更容易被腸道上皮吸收的短鏈脂肪酸，通過(guò)與脂肪細(xì)胞膜上的脂肪酸受體結(jié)合，促進(jìn)游離脂肪酸與葡萄糖吸收，從而降低血糖[23]。雙歧桿菌和乳酸桿菌是促進(jìn)機(jī)體健康的益生菌，其數(shù)量升高可以維持血糖穩(wěn)態(tài)[24]，本研究進(jìn)一步證明這一結(jié)果。研究也發(fā)現(xiàn)FBG與腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)，其原因可能是腸桿菌是一種致病菌，可以引起糖尿病患者更高的感染發(fā)病率[25]，同時(shí)腸桿菌可加劇糖脂代謝紊亂程度[26]。

兩組初發(fā)T2DM患者治療后血糖水平均有下降，小檗堿組干預(yù)前后對(duì)FBG、HbA1c的降糖療效分別為29.0%、20.87%，安慰劑組為19.48%、13.83%。小檗堿組FBG、HbA1c較安慰劑組的FBG、HbA1c水平降低(P<0.05)。本研究中觀察到兩組受試者的HOMA-IR的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但胰島素水平的改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示小檗堿可能并不通過(guò)影響胰島素水平發(fā)揮降糖作用。有研究表明，小檗堿具有與二甲雙胍、羅格列酮相似的降糖療效，但作用機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)胰島素受體的表達(dá)，提高葡萄糖的利用率，改善胰島素抵抗[27]。

本研究在干預(yù)12周后，小檗堿組GLP-1水平較安慰劑組顯著升高(P<0.05)，提示小檗堿可升高GLP-1水平。GLP-1是由腸道上皮L細(xì)胞合成并分泌的一種腸促胰素，動(dòng)物研究表明鹽酸小檗堿能夠提高L細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)而升高GLP-1的水平[28]。此外，益生元是一類(lèi)選擇性促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng)從而改善宿主健康的一類(lèi)膳食纖維，本身不被消化。服用益生元可以減少食物攝入、降低血糖，膳食纖維經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后產(chǎn)生短鏈脂肪酸，可以與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，從而觸發(fā)L細(xì)胞分泌GLP-1[29]。腸道菌群紊亂可降低GLP-1受體的表達(dá)[30]，但是尚未明確有直接作用于GLP-1特定的腸道菌群。本研究進(jìn)行相關(guān)性分析，也未發(fā)現(xiàn)能夠直接影響GLP-1水平的腸道微生物。另外，生活方式的改變也會(huì)對(duì)GLP-1產(chǎn)生一定影響，如嚴(yán)格控制飲食，增加有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)間也可以促進(jìn)L細(xì)胞分泌GLP-1[31]，在本研究中空腹血糖、胰島素的變化差異與GLP-1的變化值無(wú)相關(guān)性，因此安慰劑對(duì)照組的GLP-1水平升高可能與健康生活方式轉(zhuǎn)變有關(guān)。

綜上所述，初發(fā)T2DM患者常伴有腸道菌群失調(diào)，鹽酸小檗堿可以有效調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，同時(shí)改善初發(fā)T2DM患者胰島素抵抗、調(diào)節(jié)胃腸激素，且無(wú)明顯不良事件發(fā)生，具有良好的降糖療效及安全性。但是本研究觀察點(diǎn)較少，只對(duì)基線水平和干預(yù)12周進(jìn)行評(píng)估，且未能連續(xù)性觀察小檗堿的療效以及對(duì)腸道菌群的影響。因此，后續(xù)研究將考慮這些因素，并擴(kuò)大樣本量，通過(guò)長(zhǎng)程隨訪以動(dòng)態(tài)觀察小檗堿對(duì)2型糖尿病的降糖療效及安全性，為臨床決策提供依據(jù)。