殼聚糖生姜精油涂膜對(duì)鮮銀耳活性氧代謝和組織超微結(jié)構(gòu)的影響

羅 楊，李 娟，陳 崗,2，吳 振，詹 永,2，廖 霞，楊 勇,2*

1重慶市中藥研究院；2重慶市中藥大健康工程技術(shù)研究中心；3中藥健康學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065

銀耳(Tremellafuciformis)是一種優(yōu)質(zhì)的藥食兩用菌。中醫(yī)認(rèn)為銀耳具有滋陰潤肺、養(yǎng)胃生津的功效[1]。銀耳含有多糖、黃酮類酚類、以及多種氨基酸等活性成分，被稱為“菌中之王”[2]。鮮銀耳雖營養(yǎng)豐富，但含水量極高，采后極易腐爛變質(zhì)，故銀耳一般以干制品形式出售，嚴(yán)重降低了銀耳的營養(yǎng)品質(zhì)及附加值。隨著近年來各種綠色高效的保鮮技術(shù)的研究和發(fā)展，銀耳有望擺脫傳統(tǒng)干制產(chǎn)品的命運(yùn)，實(shí)現(xiàn)安全鮮銷。其中，包括殼聚糖、香辛料精油等天然保鮮劑因其高效、方便、安全、天然，越來越受到關(guān)注[3]。

殼聚糖是近年來備受人們關(guān)注的新型安全保鮮劑，在果蔬中應(yīng)用較多，而在食用菌保鮮中的研究還不多。有研究表明，殼聚糖可明顯降低雙孢菇的失水率、硬度、腐爛度、開傘率和褐變度，提高子實(shí)體可溶性蛋白、總糖、還原糖的含量，SOD和CAT的活性也得到誘導(dǎo)提高，并可維持細(xì)胞膜的完整性，避免PPO與酚類物質(zhì)接觸，從而抑制雙孢菇的褐變發(fā)生[4]。此外，本文作者在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，殼聚糖在常溫貯藏條件下能夠顯著降低鮮銀耳的發(fā)病率和病情指數(shù)、誘導(dǎo)提高鮮銀耳抗病及活性氧代謝能力[5]。殼聚糖能夠延緩果蔬成熟并保持其品質(zhì)，其作用機(jī)理主要是利用其成膜性和抗菌性[6]。但是，單純的殼聚糖涂膜因其抗菌性能不甚理想，殼聚糖基復(fù)合涂膜被認(rèn)為是加強(qiáng)保鮮效能的良好手段[7]。生姜精油等香辛料精油中含有抗氧化性強(qiáng)的鄰羥甲基苯甲酸內(nèi)酯、酚類及其衍生物、黃酮類、聚乙炔、香豆素等活性成分，能夠有效延緩食品中過氧化物的形成[8]，同時(shí)還對(duì)絕大多數(shù)的細(xì)菌、真菌、霉菌有較強(qiáng)的抑制效果[9]。目前，生姜精油已被廣泛應(yīng)用到禽肉保鮮領(lǐng)域[10]。故本文利用成膜性良好的殼聚糖與抗菌性較好的生姜精油進(jìn)行復(fù)配，以此進(jìn)一步提升保鮮能效。同時(shí)，目前我國生鮮冷鏈物流產(chǎn)業(yè)得到大幅度發(fā)展，鮮銀耳已有望實(shí)現(xiàn)全冷鏈鮮銷，因此有必要在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討冷藏條件下復(fù)配保鮮劑對(duì)鮮銀耳活性氧代謝的影響，并結(jié)合鮮銀耳組織微觀形貌特征對(duì)殼聚糖-生姜精油涂膜保鮮機(jī)理進(jìn)行討論，為進(jìn)一步提升鮮銀耳冷藏保鮮能效提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試銀耳：由雙福國際農(nóng)貿(mào)城鮮銀耳批發(fā)商提供。選取朵形飽滿、表面干凈、無病蟲害、大小相對(duì)一致、無機(jī)械損傷的新鮮銀耳。

1.2 主要試劑

生姜精油：經(jīng)超臨界CO2萃取獲得，由重慶華萃生物科技股份有限公司提供；殼聚糖：食品級(jí)，脫乙酰度50%～60%，黏度200 mps，山東濰坊海之源生物科技有限公司提供。其他化學(xué)試劑：均為分析純。

1.3 殼聚糖-生姜精油保鮮劑制備方法

將10 g殼聚糖溶于1L 0.5%(V/V)乙酸水溶液中，放于恒溫水浴鍋中，70 ℃恒溫水浴20 min，攪拌使其完全溶解，冷卻后，加入10 g的生姜精油及3 g單甘酯，補(bǔ)足余量的水，磁力攪拌20 min，將乳液高壓均質(zhì)3次，均質(zhì)壓力35 MPa，均質(zhì)后即得殼聚糖-生姜精油保鮮劑。

1.4 保鮮處理

選取質(zhì)量為130～150 g/朵的鮮銀耳，清除菌體表面的雜質(zhì)，噴灑殼聚糖-生姜精油保鮮液20次(每次劑量1 mL)。對(duì)照處理組以蒸餾水噴灑20次(每次劑量1 mL)。待銀耳表面液體自然吸收瀝干后，將其放入帶蓋的PE材質(zhì)塑料保鮮盒中(每個(gè)盒子裝1朵銀耳)，置于4 ℃，相對(duì)濕度90%的環(huán)境中貯藏，定期觀察及取樣測定。

1.5 測定指標(biāo)及方法

貯藏后第0、10、20、30、40天隨機(jī)取樣測定各種指標(biāo)。

1.5.1 發(fā)病率的測定

每隔一段時(shí)間觀察統(tǒng)計(jì)銀耳發(fā)病率，殼聚糖-生姜精油涂膜處理組與對(duì)照組各20朵銀耳，重復(fù)三次。

1.5.2 病情指數(shù)測定

病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)銀耳朵數(shù)×各級(jí)代表值)/(銀耳總朵數(shù)×最高級(jí)代表值)

0級(jí)：全朵無??；1級(jí)：全朵25%以下的耳片有少數(shù)病斑；2級(jí)：全朵50%以下的耳片有少量病斑或25%以下的耳片有較多的病斑數(shù)；3級(jí)：全朵75%以下的耳片發(fā)病或全朵25%以下的耳片完全霉變腐爛；4級(jí)：全朵75%以上的耳片發(fā)病或全朵50%以下的耳片完全霉變腐爛～整朵霉變腐爛。

1.5.3 失重率的測定

采用稱重法，每隔12 h測定一次銀耳失重率，殼聚糖-生姜精油涂膜處理組與對(duì)照組各10朵銀耳。重復(fù)三次。計(jì)算方法如下：

1.5.4 過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的提取及活力測定

參照Zauberman[11]的方法測定。

參照Wang[12]的方法測定。

1.5.6 過氧化氫(H2O2)含量測定

參照Patterson[13]的方法測定。

1.5.7 過氧化氫酶(CAT)提取及活力測定

取1.0 g鮮銀耳，加入3.0 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5)(含5 mmol/L二硫代蘇糖醇和2%聚乙烯吡咯烷酮)，在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃、12 000 rpm離心30 min，收集上清液，用于CAT活性測定。

CAT活性參考Beers和Sizer[14]的方法測定。

1.5.8 超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活力測定

SOD活性參考Luo[5]的方法測定。

1.5.9 涂膜銀耳的微觀結(jié)構(gòu)表征觀察

采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)對(duì)殼聚糖-生姜精油保鮮液處理后的鮮銀耳分別在低溫(4 ℃)貯藏0天和30天進(jìn)行微觀形貌觀察，并設(shè)立空白對(duì)照銀耳。

具體方法是，取鮮銀耳1 cm2左右，用雙面膠粘于測試臺(tái)，直接于離子濺射儀上噴鍍金屬鉑，在SEM下觀察其微觀形貌。電鏡測試條件為JEM-2000FX分析型掃描電子顯微鏡，加速電壓為3.0 kV，不同倍數(shù)下比較觀察保鮮液處理鮮銀耳與對(duì)照樣品表面微觀形貌。

1.5.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖形分析

用Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤、制圖；并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳自然發(fā)病率、病情指數(shù)的影響

圖1 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳自然發(fā)病率、病情指數(shù)的影響Fig.1 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on disease incidence anddisease index of freshtremella注：圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤，下同；不同字母表示相同貯藏天數(shù)時(shí)與對(duì)照組差異顯著。Note:Bars indicate the standard errors,the same below;Different letters indicated significant difference between the treatment group and the control group at the same storage days.

鮮銀耳的殼聚糖-生姜精油涂膜處理組自然發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。處理組鮮銀耳在4 ℃貯藏10天時(shí)發(fā)病率為0，而對(duì)照組發(fā)病率為5.0%；貯藏20天時(shí)處理組發(fā)病率為4.15%，對(duì)照組發(fā)病率為14.53%，對(duì)照組發(fā)病率約是處理組的3.5倍；貯藏40天后處理組發(fā)病率為17.6%，對(duì)照組發(fā)病率為36.7%，對(duì)照組比處理組高2.1倍。新鮮銀耳在20 ℃貯藏10天時(shí)處理組病情指數(shù)為0，對(duì)照組為3.3；貯藏20天時(shí)處理組病情指數(shù)為2.13，對(duì)照組為8.56，對(duì)照組病情指數(shù)約是處理組的4倍；貯藏30天時(shí)處理組病情指數(shù)為3.86，對(duì)照組為13.75，對(duì)照組比處理組高3.56倍。整個(gè)貯藏期間，殼聚糖-生姜精油涂膜處理都顯著降低了新鮮銀耳的發(fā)病率和腐爛程度。

2.2 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳失重率的影響

殼聚糖有良好的成膜性，能在鮮銀耳表面形成一層類似氣調(diào)包裝的薄膜，抑制呼吸作用，阻止水分的蒸騰和散失[17]，從而降低鮮銀耳在貯藏期間尤其是貯藏后期的失重率(圖2)。貯藏30天時(shí)，殼聚糖-生姜精油涂膜處理鮮銀耳失重率為3.15%，對(duì)照組失重率為6.75%，失重率降低53.3%，二者差異顯著(P<0.05)。整個(gè)貯藏期間，殼聚糖-生姜精油涂膜處理都明顯降低了鮮銀耳失重率，保持了銀耳質(zhì)量。

圖2 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳失重率的影響Fig.2 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on weight loss rate of fresh tremella 注：*相同貯藏天數(shù)時(shí)與對(duì)照組差異顯著，下同。Note:*There is significant difference between the treatment group and the control group at the same storage days,the same below.

2.3 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳POD、PPO活性的影響

過氧化物酶(POD)是植物細(xì)胞中主要的氧化酶，在許多果蔬上表現(xiàn)為一種衰老酶，其活性提高是果蔬成熟衰老的體現(xiàn)[18]。本研究結(jié)果表明，鮮銀耳的POD活性在貯藏期間呈先上升后下降趨勢(shì)(圖3)，相比對(duì)照組在貯藏10天時(shí)POD活性急劇上升，殼聚糖-生姜精油涂膜處理顯著抑制了鮮銀耳的POD活性，活性比對(duì)照低37.8%，差異顯著(P<0.05)。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，處理組POD活性都低于對(duì)照組，這表明殼聚糖-生姜精油涂膜有抑制鮮銀耳POD活性上升的作用。

多酚氧化酶(PPO)是引起植物組織褐變的重要酶之一，且與果蔬的抗病性有關(guān)[19]。鮮銀耳PPO活性在貯藏期間呈下降趨勢(shì)(圖3)。但殼聚糖-生姜精油涂膜處理可延緩鮮銀耳PPO活性下降，在貯藏期間均高于對(duì)照，且在第10天和30天時(shí)促進(jìn)PPO活性上升。這表明殼聚糖-生姜精油涂膜處理提高了鮮銀耳PPO活性，從而延緩褐變、衰老，延長鮮銀耳的貯藏保鮮期。

圖3 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳POD、PPO活性的影響Fig.3 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on POD and PPOactivity of fresh tremella

2.4 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳和H2O2含量的影響

圖4 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳及H2O2含量的影響Fig.4 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on H2O2 contentof fresh tremella

2.5 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳CAT、SOD活性的影響

圖5 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳CAT、SOD活性的影響Fig.5 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on CAT and SOD activity of fresh tremella

過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)在清除自由基、延緩衰老等方面有著重要的作用[22]。鮮銀耳CAT活性在貯藏期間呈先下降后逐漸上升趨勢(shì)(圖5)，而殼聚糖-生姜精油涂膜處理可顯著提高鮮銀耳貯藏前期的CAT活性，第10天和第20天時(shí)其活性分別為對(duì)照組的2.4和2.5倍，差異顯著(P<0.05)。

2.6 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對(duì)鮮銀耳微觀形貌特征的影響

從圖6和圖7的SEM掃描結(jié)果可看出，在貯藏初期(0天)，對(duì)比A和B樣品，保鮮液吸附在菌絲體上，并填充到子實(shí)體中，使得保鮮處理的鮮銀耳的組織空隙被填滿，菌絲細(xì)胞比對(duì)照變得更粗壯、飽滿，而未經(jīng)保鮮液處理的鮮銀耳子實(shí)體表面則有很多充滿水的空隙。低溫貯藏30天后，涂膜保鮮液處理銀耳(樣品C)外觀保持良好，微觀形貌較貯藏初期(樣品A)有略微變化，菌絲體間開始出現(xiàn)少量空隙，但此時(shí)對(duì)照銀耳(樣品D)外觀已出現(xiàn)脫水變黃、萎焉，微觀形貌則表現(xiàn)為脫水后菌絲細(xì)胞扁平的擠壓在一起。從圖8的銀耳色澤來看，C和A相比幾乎無變化；但D相比B明顯出現(xiàn)了黃色，且整朵銀耳開始脫水、萎焉。

圖6 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳表面微觀形貌(×500)Fig.6 The surface microstructure of freshtremella with chitosan ginger oil coating(×500)注：A為殼聚糖-生姜精油涂膜處理銀耳貯藏0天；B為對(duì)照銀耳貯藏0天；C為殼聚糖-生姜精油涂膜處理銀耳4 ℃貯藏30天；D為對(duì)照銀耳4 ℃貯藏30天，下同。Note:A:Fresh tremella a with chitosan ginger oil coating for 0 days;B:Control tremella for 0 days;C:Fresh tremellawith chitosan ginger oil coating stored at 4 ℃ for 30 days;D:Control tremella at 4 ℃ for 30 days,the same below.

圖7 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳表面微觀形貌(×2 000)Fig.7 The surface microstructure of fresh tremellawith chitosan ginger oil coating(×2 000)

圖8 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳照片F(xiàn)ig.8 Photo of fresh tremellawith chitosan ginger oil coating

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖-生姜精油成膜液形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，附著在銀耳表面，填充了銀耳菌絲細(xì)胞空隙，其作用類似于氣調(diào)包裝，隔絕外界微生物的侵染，防止鮮銀耳水分及營養(yǎng)成分流失，很好地保持了鮮銀耳的品質(zhì)。

3 討論

由于生姜精油具有辛辣味、易揮發(fā)、易氧化等缺點(diǎn)，限制了其作為保鮮劑等食品添加劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用。而生姜精油通過與殼聚糖復(fù)配，形成了具有良好穩(wěn)定性的保鮮劑[24]，能很好地解決精油中有效抑菌成分不穩(wěn)定、易揮發(fā)、影響保鮮產(chǎn)品品質(zhì)等問題，且較單獨(dú)使用殼聚糖涂膜[5]保鮮效果更好。精油與成膜劑混合均勻，形成精油液滴與多糖結(jié)合的“疏水-親水”半透膜，既保留了糖類物質(zhì)的膜功能特性，且均勻分散的精油所形成的疏水性又使親水性物質(zhì)與鮮銀耳表面和空氣相隔絕，從而達(dá)到延長鮮銀耳貨架期的目的；半透膜能夠覆蓋在銀耳表面的微孔上，并部分滲入到銀耳組織中，減小表皮組織的孔隙，從而抑制食用菌的呼吸及蒸騰作用；成膜液是基于多糖分子因相互作用形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖6、圖7)，類似于氣調(diào)包裝，從而對(duì)鮮銀耳起到隔絕環(huán)境的作用，避免受外界微生物侵染，減少機(jī)械損傷及腐爛，降低鮮銀耳失重率(圖2)。

POD一般被認(rèn)為是果實(shí)成熟和衰老的標(biāo)志性指標(biāo)。PPO與果蔬抗病性和褐變發(fā)生密切相關(guān)，它們可催化木質(zhì)素及其它酚類物質(zhì)的氧化，并提高機(jī)體抗病能力。本研究結(jié)果表明，殼聚糖-生姜精油提高鮮銀耳PPO活性(圖3)，對(duì)鮮銀耳POD活性的上升則有抑制作用(圖3)，說明殼聚糖-生姜精油涂膜可誘導(dǎo)鮮銀耳抗病性增強(qiáng)，顯著降低腐爛發(fā)病率及發(fā)病程度(圖1)，延緩褐變、衰老，延長鮮銀耳的貯藏保鮮期(圖8)。

綜上所述，殼聚糖-生姜精油一方面通過良好的成膜性，形成致密的類似氣調(diào)包裝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，避免外界微生物侵染，減少機(jī)械損傷，防止鮮銀耳水分及營養(yǎng)成分流失；另一方面也能通過影響活性氧代謝，激發(fā)銀耳體內(nèi)包括SOD途徑、CAT途徑等一系列清除活性氧、增強(qiáng)抗病性的反應(yīng)，但因銀耳機(jī)體處于低溫狀態(tài)下，活性氧H2O2的產(chǎn)生和清除趨于平衡的狀態(tài)，說明低溫可延緩鮮銀耳的活性氧代謝高峰的到來，有效抑制膜質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，這對(duì)保持鮮銀耳組織的完整性和品質(zhì)具有重要的意義。

目前，全國的冷鏈物流產(chǎn)業(yè)得到空前的發(fā)展和壯大，在此基礎(chǔ)上，通過天然保鮮劑復(fù)配涂膜等技術(shù)手段增強(qiáng)冷鏈保鮮能效，可提升銀耳產(chǎn)品附加值和產(chǎn)業(yè)發(fā)展空間，更能拉動(dòng)冷鏈物流產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和進(jìn)步。因此筆者認(rèn)為，利用殼聚糖、生姜精油等天然成分復(fù)配涂膜結(jié)合冷鏈物流等新興高效安全的保鮮技術(shù)應(yīng)對(duì)銀耳采后貯藏難的問題，較常溫貯運(yùn)狀態(tài)下使用單一保鮮劑保鮮能效提升不少，若能將其成功商業(yè)化應(yīng)用于銀耳乃至其他食用菌采后保鮮領(lǐng)域，是提高銀耳貯藏安全性和商品附加值，滿足當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)鮮食農(nóng)產(chǎn)品天然、綠色、安全、健康的需求的有效途徑。