基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的血必凈注射液干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴輔助治療重癥新型冠狀病毒肺炎的潛在機(jī)制研究

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，木哈待斯·努爾，努麗比亞·買合木提，周文婷*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011

2019年12月，在武漢市暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎疫情。2020年2月世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布，新型冠狀病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，由這一病毒導(dǎo)致的疾病的正式名稱為COVID-19(corona virus disease 2019)。截止到2020年3月25日國(guó)內(nèi)外已有33萬(wàn)多名確診病例。患者有嚴(yán)重的急性呼吸系統(tǒng)(SARI)癥狀，包括發(fā)燒、呼吸困難、乏力、咳嗽和肺炎等[1]。研究表明，COVID-19 患者炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，重癥患者相比輕癥患者，血漿多種促炎因子表達(dá)水平明顯更高，認(rèn)為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是COVID-19主要的致病機(jī)制之一[2]。細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)指的是高濃度的不受控制的細(xì)胞因子釋放，是引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭的重要因素。

從疫情發(fā)生后，國(guó)家衛(wèi)生健康委聯(lián)合國(guó)家中醫(yī)藥管理局在《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)的通知》中要求加強(qiáng)中西醫(yī)結(jié)合，并推薦了多個(gè)中成藥在診治過程中使用，建立中西醫(yī)聯(lián)合會(huì)診制度，盡量早期進(jìn)行中醫(yī)藥治療，以共同促進(jìn)COVID-19臨床療效的提高。其中血必凈注射液為《診療方案》中推薦使用的中成藥，用于COVID-19重型、危重型患者治療。血必凈注射液(Xuebijing injection，XBJI)是純中藥制劑，由紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸等5味中藥提取制成，在防治細(xì)胞因子風(fēng)暴方面具有一定的科學(xué)依據(jù)和臨床基礎(chǔ)[3]。研究報(bào)道[4]，對(duì)20例重癥肺炎合并膿毒癥患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示應(yīng)用血必凈注射液治療效果確切。還有研究報(bào)道[5]，對(duì)126例老年重癥肺炎合并呼吸衰竭患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合使用血必凈注射液能顯著改善患者肺部氧合功能，提高臨床療效。因此，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析血必凈注射液干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)的信號(hào)通路和潛在靶點(diǎn)，從而防治COVID-19，提高中醫(yī)藥治療重癥COVID-19患者的參與度提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 血必凈注射液活性成的收集及篩選

XBJI的5味草藥通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進(jìn)行成分的收集。收集所得的所有化學(xué)成分通過TCMSP分析平臺(tái)的藥物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)ADME參數(shù)的限制對(duì)其中可能的活性成分進(jìn)行篩選、做進(jìn)一步分析。DL是與良好的臨床療效相關(guān)聯(lián)的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性。DL越大，則成藥性越高。Lipinski指出，類藥化合物系具有在人體藥代藥動(dòng)學(xué)過程中表現(xiàn)為較好的ADME特性和安全性，是綜合了藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與藥物的安全性的指標(biāo)[6]。對(duì)于通過口服途徑給藥的藥物，OB 是最重要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一，是衡量藥物進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)有效性的一個(gè)重要指標(biāo)。良好的口服生物利用度是化合物具有藥理活性的基本前提之一。以系統(tǒng)藥理學(xué)方法來分析傳統(tǒng)中醫(yī)藥時(shí)，OB≥30和DL≥0.18為篩選生物活性成分的標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2 活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及篩選

首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。然后，將所有靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)以“homo sapiens”(人屬)為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)化，即將全部蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.3 細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)靶點(diǎn)的篩選及其與血必凈共有潛在靶點(diǎn)的篩選

利用 “cytokine storm” 作為關(guān)鍵詞，對(duì)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)進(jìn)行已知的細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)靶點(diǎn)的檢索及篩選，并刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點(diǎn)。此靶點(diǎn)與XBJI活性成分的靶點(diǎn)映射后得到共有的潛在靶點(diǎn)。通過Cytoscape3.7.1軟件(https://cytoscape.org)構(gòu)建草藥-潛在成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(herb-potential compound-potential target，HB-pC-pT network)。

1.4 GO基因功能和KEGG通路分析

以上得到的XBJI干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的潛在靶點(diǎn)通過DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因功能(GO)和信號(hào)通路分析(KEGG)。

2 結(jié)果

2.1 血必凈注射液活性成分分子庫(kù)篩選及其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

XBJI的5味草藥通過TCMSP，TCMID和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到925個(gè)成分，其中紅花201個(gè)、赤芍138個(gè)、川芎192、丹參218個(gè)和當(dāng)歸176個(gè)(表1)。并將成分通過OB≥30和DL≥0.18篩選，并刪除重復(fù)的成分后得到71個(gè)活性成分，XBJI活性成分ADME的基本信息見表2。以上得到71個(gè)活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選其對(duì)應(yīng)的1 132個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名稱-蛋白名稱轉(zhuǎn)換，并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)名稱后得到241個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 XBJI 5味草藥的總成分

表2 XBJI活性成分的ADME篩選

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2 細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)靶點(diǎn)的篩選及其與血必凈注射液共有潛在靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

通過CTD數(shù)據(jù)庫(kù)以“cytokine storm” 作為關(guān)鍵詞篩選得到與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的83個(gè)靶點(diǎn)。此靶點(diǎn)與241個(gè)XBJI活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行映射得到27個(gè)共有的潛在靶點(diǎn)(圖1)。從Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，得到作用于27個(gè)潛在靶點(diǎn)的17個(gè)潛在成分。并構(gòu)建5個(gè)草藥-17個(gè)潛在成分-27個(gè)潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(HB-pC-pT network)，如圖2所示。該網(wǎng)絡(luò)由49個(gè)節(jié)點(diǎn)(5個(gè)草藥、17個(gè)潛在成分和27個(gè)潛在靶點(diǎn))和100個(gè)邊緣組成。HB(綠色八角形)、pC(黃色四角形)和pT(紅色圓形)之間的邊緣代表相互作用。一個(gè)節(jié)點(diǎn)度(degree)代表在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。節(jié)點(diǎn)的大小與度數(shù)成正比。節(jié)點(diǎn)的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)[8]。從潛在成分的角度分析，其中degree排在前5位的有槲皮素(degree=25)、木犀草素(degree=13)、山奈酚(degree=11)、β-胡蘿卜素(degree=8)和黃芩素(degree=7)。從潛在靶點(diǎn)的角度分析，degree≥5的靶點(diǎn)分別為CASP3、RELA、GSK3B、IL-6、IL-1β、TNF、IL-10。結(jié)果表明，以上潛在成分及其潛在靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)度越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)。以上結(jié)果可以看出來，血必凈注射液中存在一個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)作用，同時(shí)也存在不同成分共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。草藥中丹參與活性成分的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)最多(degree=9)，是血必凈注射液的主藥。近期研究報(bào)道，丹參為活血化瘀的代表藥，其抗炎機(jī)制符合新冠病毒引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的病理特點(diǎn)，使用丹參進(jìn)行組方將有利于抑制新冠肺炎炎癥發(fā)展并改善肺部微循環(huán)[9]。

圖1 血必凈注射液和細(xì)胞因子風(fēng)暴共有潛在靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 The venn diagram of cytokine storm and XBJI common potential targets

圖2 草藥-潛在成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 HB-pC-pT network

2.4 GO基因功能和KEGG通路分析結(jié)果

為了系統(tǒng)地解釋XBJI輔助治療COVID-19的作用機(jī)制，將27個(gè)潛在靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO基因功能和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，作用靶點(diǎn)涉及到214條目生物過程(biological process，BP)、32條目分子功能(molecular function，MF)、16條目細(xì)胞組分(cellular component，CC)(見圖3)以及86條KEGG信號(hào)通路。KEGG信號(hào)通路按照FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，F(xiàn)DR≤0.01)大小進(jìn)一步篩選，F(xiàn)DR表示在富集分析中越小，就代表富集顯著程度就越高。以FDR≤0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到8條主要信號(hào)通路以及參與的21個(gè)潛在靶點(diǎn)，如圖4所示。其中FDR最小的通路是TNF信號(hào)通路。

圖3 血必凈注射液的GO基因功能分析Fig.3 GO analysis of the target of XBJI active components

圖4 血必凈注射液的信號(hào)通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of the target of XBJI active components

3 討論

2019年12月以來，細(xì)胞因子風(fēng)暴再次進(jìn)入了人們的視線，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、疾病進(jìn)展迅速、死亡率較高。細(xì)胞因子風(fēng)暴起源于抗原刺激，在正常情況下，機(jī)體通過“正反饋”調(diào)節(jié)對(duì)抗外界來的病原體，抗原信號(hào)傳遞給免疫系統(tǒng)的信號(hào)減弱，細(xì)胞因子釋放就會(huì)開始減少，從而形成“負(fù)反饋”(負(fù)循環(huán))調(diào)節(jié)[10]。而細(xì)胞因子風(fēng)暴的本質(zhì)是免疫紊亂，當(dāng)兇猛病毒入侵機(jī)體時(shí)，比如此時(shí)正在暴虐的SARS-CoV-2感染等，因免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡、負(fù)反饋的缺失和正反饋的不斷自我放大，人體免疫系統(tǒng)會(huì)釋放大量的細(xì)胞因子，這使細(xì)胞因子信號(hào)變大。細(xì)胞因子風(fēng)暴的后果是組織損傷，即細(xì)胞因子信號(hào)的變大，可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡，引起細(xì)胞因子風(fēng)暴而導(dǎo)致疾病惡化[11]。對(duì)以上后果的防治應(yīng)以早期干預(yù)為主，中醫(yī)藥在此方面有著獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。

目前，對(duì)于SARS-CoV-2 感染及其引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴還沒有特效藥物?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝自\療方案(試行第六版)》指出，對(duì)于重型、危重型病例的治療，主要有呼吸支持、循環(huán)支持、康復(fù)者血漿治療，必要時(shí)酌情使用糖皮質(zhì)激素，可使用血必凈注射液和腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)效應(yīng)和整體調(diào)理作用，部分組分具備一定程度的抗菌抗病毒效果，其抗病毒的研究要注重整體效應(yīng)，不僅單從某一個(gè)指標(biāo)來解釋，更加考慮各指標(biāo)或因子間的相互作用，以整體調(diào)節(jié)作用有助于從源頭阻止細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生[12]。研究報(bào)道[13]，血必凈注射液對(duì)甲型H1N1病毒感染重癥肺炎小鼠的臟器保護(hù)作用。此外，用于治療老年重癥肺部感染可明顯改善患者高凝狀態(tài)，降低炎癥因子水平，調(diào)節(jié)免疫功能，有效保護(hù)患者的肺臟功能和組織結(jié)構(gòu)，以減輕肺損傷，可糾正機(jī)體的“過度免疫”，從而有利于控制疾病向“細(xì)胞因子風(fēng)暴”發(fā)展[14]。

細(xì)胞因子包括促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-2、IL-8、IL-1β、TNF-α和抗炎細(xì)胞因子如IL-4、IL-11、IL-13、IL-10、IL-1。這兩者之間平衡是維持機(jī)體的正常免疫功能和抵抗疾病的關(guān)鍵因子。從HB-pC-pT網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可以看出來，IL-6、IL-1β和TNF-α促炎細(xì)胞因子以及IL-10抗炎細(xì)胞因子等靶點(diǎn)在血必凈注射液干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴方面生物學(xué)功能比較強(qiáng)。據(jù)《柳葉刀》論文報(bào)道，在早期的99個(gè)病例中，17個(gè)COVID-19患者出現(xiàn)了由細(xì)胞因子風(fēng)暴造成的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷而導(dǎo)致ARDS的發(fā)生，病情短期內(nèi)出現(xiàn)惡化，伴隨呼吸衰竭并最終多器官衰竭致死，共有11例死亡[15]，臨床發(fā)現(xiàn)大量升高的細(xì)胞因子主要為IL-6、TNF-α、IFN-γ等[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的患者也有大量的IL-Iβ、INF-γ、IP-10和MCP-1。SARS-CoV-2感染同時(shí)也導(dǎo)致了抑制炎癥的IL-4和 IL-10的分泌增加[17]。研究報(bào)道，血必凈注射液通過下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子以及上調(diào)IL-10抗炎細(xì)胞因子而發(fā)揮明顯的抗炎作用，并通過影響機(jī)體免疫細(xì)胞的數(shù)量來調(diào)節(jié)免疫功能，可有效保護(hù)患者的肺臟功能和組織結(jié)構(gòu)，以減輕肺損傷[18,19]。又研究報(bào)道，槲皮素和芍藥苷會(huì)下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF以及上調(diào)IL-10而發(fā)揮抗炎作用[20-22]。而本研究結(jié)果表明，血必凈注射液活性成分中槲皮素和芍藥苷主要作用于IL-6、IL-1β、TNF和IL-10，這與前期研究報(bào)道相符合。

KEGG信號(hào)通路結(jié)果表明，TNF信號(hào)通路的FDR最小，說明TNF信號(hào)通路是血必凈注射液干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要信號(hào)通路，其次是T細(xì)胞信號(hào)通路。研究報(bào)道，血必凈注射液能下調(diào)對(duì)T細(xì)胞增殖和分泌功能的抑制效應(yīng)[23]。由此可見，血必凈注射液主要通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、促進(jìn)IL-10分泌、下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1β調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，糾正機(jī)體的“過度免疫”，有利于控制疾病向“細(xì)胞因子風(fēng)暴”發(fā)展。本文研究血必凈注射液與細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，探討其輔助治療重癥COVID-19相關(guān)的作用路徑和潛在的機(jī)制靶點(diǎn)，為臨床治療提供有價(jià)值的用藥指導(dǎo)。