基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接對(duì)逍遙散干預(yù)原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制研究

商志浩，潘成鎮(zhèn)，馬月輝，謝卓容，韋紫怡，羅偉生，彭 岳，岑妍慧,2*

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530000

原發(fā)性肝癌(HCC)是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，有流行廣、起病緩慢、出現(xiàn)癥狀后疾病進(jìn)展迅速、侵襲性強(qiáng)、病死率高[1]的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌死亡率在惡性腫瘤城市死亡率中居于第二位，僅次于肺癌；農(nóng)村居于第二位，僅次于胃癌。目前我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，并且我國(guó)的肝癌發(fā)病率是全球最高，肝癌發(fā)病人數(shù)占全球的50%以上[2]，對(duì)我國(guó)人民的身體健康造成嚴(yán)重威脅。肝癌可發(fā)生于任何年齡，其中以35～55歲最多，男女之比約為1∶1～4∶1。早期切除是療效較好的治療方法之一，但大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已屬晚期，多數(shù)已錯(cuò)過(guò)手術(shù)時(shí)機(jī)，所能采用的現(xiàn)代綜合治療方法常被限制在放化療和免疫治療上，而放化療對(duì)本病的治療毒副反應(yīng)大，適應(yīng)證少，療效往往難以令人滿(mǎn)意。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療是本病的主要治療手段之一。

逍遙散，中醫(yī)方劑名。出自《太平惠民和劑局方》卷九。逍遙散為和解劑，具有疏肝解郁，養(yǎng)血健脾之功效，主治肝郁血虛脾弱證。目前，醫(yī)療工作者做了一定量的關(guān)于逍遙散治療原發(fā)性肝癌及其并發(fā)癥的臨床研究，如Xiong等[3]選取了72例原發(fā)性肝癌患者，將其分成三組分別使用西藥化療加苦參注射液、西藥單純化療、西藥化療加逍遙散加減進(jìn)行治療，結(jié)果用西藥化療加逍遙散治療組相較于其他對(duì)照組取得了較好療效，根據(jù)病人的各方面數(shù)據(jù)也顯示逍遙散具有改善原發(fā)性肝癌患者的肝功能、生活質(zhì)量、外周血白細(xì)胞等作用。但是由于逍遙散成分復(fù)雜多樣，其治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制目前尚未有明確研究報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)新興的的一門(mén)學(xué)科，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，探究疾病及藥物的相互作用機(jī)理，與復(fù)雜疾病的治療理念相吻合[4]，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及中藥作用機(jī)制的闡述。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)挖掘、統(tǒng)計(jì)推斷、生物信息學(xué)等方法，構(gòu)建逍遙散與原發(fā)性肝癌相互作用的藥物與生物分子復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘藥物作用靶點(diǎn)及藥物與內(nèi)源性蛋白及生物通路的作用關(guān)系，從而合理預(yù)測(cè)和科學(xué)推斷有效物質(zhì)成分的作用靶點(diǎn)及其調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程和機(jī)制，力求更全面深入揭示逍遙散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療原發(fā)性肝癌的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)

使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取并分析得出HCC的差異基因；TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)用于獲取逍遙散中的有效成分及作用靶點(diǎn)；對(duì)應(yīng)逍遙散與HCC的交集基因，綜合BioGRID、BIND、MINT、HPRD、DIP、GRID數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；利用David數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析；PDB數(shù)據(jù)庫(kù)用于下載關(guān)鍵蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

1.2 基因芯片篩選

以“l(fā)iver cancer normal”作為檢索詞，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出同時(shí)含有肝癌組織和正常組織的人源基因芯片，并下載基因芯片的matrix文件，文件編號(hào)：GSE118916，以獲取樣本信息。

1.3 差異基因(DEGS)的篩選與處理

使用GEO2R在線(xiàn)分析工具,從基因芯片中篩選肝癌組織與正常組織的差異基因。并以adj.P.Val<0.05，2Ilog2(FC)I>1為條件，從中篩選出肝癌組織中較正常組織顯著上調(diào)、下調(diào)的差異基因，借助MEV4.9.0(Multi Experiment Viewer)繪制基因聚類(lèi)熱圖及火山圖。

1.4 逍遙散的活性成分及靶點(diǎn)挖掘

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)是一個(gè)獨(dú)特的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)，它能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，能夠從整體層面研究藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，揭示中藥性質(zhì)與作用機(jī)制[5-7]。從TCMSP在線(xiàn)平臺(tái)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取逍遙散(柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草)中各味中藥的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(OB)和類(lèi)藥性(DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將OB≥30%，DL≥0.18設(shè)為篩選條件[8]。借助美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種限定為“人”，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因。

1.5 “中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將中藥的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與HCC相關(guān)靶點(diǎn)取交集，所得交集靶點(diǎn)即為逍遙散作用于HCC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)(node)代表逍遙散中所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)；邊(edge)展現(xiàn)了中藥活性成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，根據(jù)活性成分與靶點(diǎn)連接情況篩選出逍遙散作用于HCC的關(guān)鍵成分。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制主要借助Cytoscape3.7.2軟件中的BisoGenet插件，其中BisoGenet由6種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成的，包括Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)。本研究將上述逍遙散的作用靶點(diǎn)和HCC相關(guān)的疾病靶點(diǎn)分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，借助 BisoGenet 插件對(duì)2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制，同時(shí)利用 cytoscape3.7.2合并2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行抽取，抽取獲得的交集網(wǎng)絡(luò)即為逍遙散治療HCC的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，并借助自由度、緊密度、特征向量中心性、中心中介性、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標(biāo)，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出邊數(shù)大于250的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，即“Big hubs”；然后篩選網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)中心度大于61的節(jié)點(diǎn)，即為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因[9]。上述獲得的相關(guān)成分及靶點(diǎn)則有可能是直接、間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)，發(fā)揮治療HCC的作用。

1.7 GO基因功能富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言中的“DOSE”、“clusterProfiler”、“enrichplot”R包對(duì)交集基因進(jìn)行GO功能富集分析，進(jìn)一步闡釋中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用。

1.8 KEGG通路富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”R包對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，進(jìn)一步闡釋中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在通路功能中的作用。

1.9 逍遙散核心成分與關(guān)鍵靶基因的分子對(duì)接驗(yàn)證

先用ChemOffice軟件構(gòu)建活性成分的3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)(https://www.rcsb.org/)下載關(guān)鍵蛋白的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用AutoDock軟件將活性成分及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對(duì)接。結(jié)合能小于0說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，目前對(duì)于活性分子的靶點(diǎn)篩選尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，這里通過(guò)對(duì)“藥物—HCC”交集靶點(diǎn)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出兩者共有且度值最高的兩個(gè)蛋白分別與藥物中與之作用的同樣度值最高的兩個(gè)分子進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 HCC相關(guān)差異基因表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片進(jìn)行挖掘分析，獲取HCC患者肝組織與正常人肝組織的基因表達(dá)譜中明顯影響和改變的基因共580個(gè)，其中上調(diào)基因280個(gè)，下調(diào)基因413個(gè)。差圖1,火山圖見(jiàn)圖2。

圖1 HCC差異基因熱圖Fig.1 The thermogram of HCC differential gene

2.2 化合物有效活性成分篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件，對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，得到逍遙散中活性成分2 241個(gè)，其中來(lái)自柴胡的活性成分347個(gè)，來(lái)自當(dāng)歸的活性成分65個(gè)，來(lái)自白芍的活性成分118個(gè)，來(lái)自白術(shù)的活性成分22個(gè)，來(lái)自茯苓的活性成分29個(gè)，來(lái)自甘草的活性成分1 660個(gè)。

2.3 逍遙散有效活性成分—HCC網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將2 241個(gè)靶點(diǎn)與580個(gè)HCC差異基因取交集，得到27個(gè)交集基因，對(duì)應(yīng)逍遙散中99個(gè)候選活性成分，其中對(duì)應(yīng)甘草化合物77個(gè)，柴胡活性成分7個(gè)，茯苓活性成分4個(gè)，白術(shù)活性成分3個(gè)，白芍活性成分2個(gè)，混合活性成分6個(gè)。逍遙散有效活性成分見(jiàn)表1。借助軟件 Cytocsape3.7.2構(gòu)建中藥活性成分—靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有127個(gè)節(jié)點(diǎn)(逍遙散活性成分節(jié)點(diǎn)100個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)27個(gè))和183條邊，見(jiàn)圖3。圖中度值最高的活性成分為槲皮素(quercetin)，其次為山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、甘草查爾酮A(licochalcone A)等。這些度值較高的活性成分可能是逍遙散治療HCC的關(guān)鍵活性成分。

表1 逍遙散干預(yù)HCC的有效分子成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖3 逍遙散有效活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Xiaoyaosan compound-target network注：綠色橢圓：甘草活性成分；綠色橢圓：白芍活性成分；藍(lán)色橢圓：柴胡活性成分；紅色橢圓：白術(shù)活性成分；灰色橢圓：逍遙散復(fù)合物活性成分；黃色橢圓：茯苓活性成分；粉色三角：靶基因。Note:Green ellipse:Gancao compound;Light green ellipse:Baishao compound;Blue ellipse:Chaihu compound;Red ellipse:Baizhu compound;Gray ellipse:Xiaoyaosan complex compound;Yellow ellipse:Fuling compound;Pink Triangle:Target gene.

2.4 逍遙散治療HCC的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4.1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，本研究發(fā)現(xiàn)逍遙散可以與1 375個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，而這些靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系多達(dá)24 942種。本研究利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步深入分析逍遙散影響HCC發(fā)生、發(fā)展中的靶點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為網(wǎng)絡(luò)分析和機(jī)制的探討提供了可能。

2.4.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

本研究使用Bisogenet插件，以DC≥61，BC≥250為條件，對(duì)逍遙散調(diào)控HCC的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選，旨在尋找網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并在網(wǎng)絡(luò)中獲得更多節(jié)點(diǎn)的傳遞信息和更高的節(jié)點(diǎn)信息傳遞效率，充分發(fā)揮其在網(wǎng)絡(luò)中重要的作用。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，本研究共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)50個(gè)，見(jiàn)表2，篩選策略示意圖見(jiàn)圖4。

圖4 逍遙散干預(yù)HCC核心靶點(diǎn)篩選策略示意圖Fig.4 Schematic diagram of Xiaoyaosan’s selection strategy for interfering with HCC core targets

表2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.5 GO功能分析結(jié)果

27個(gè)逍遙散—HCC交集基因影響了271個(gè)生物學(xué)過(guò)程，選取P值排名20的功能信息，圖5～7。圖表顯示逍遙散活性成分主要富集在無(wú)機(jī)物質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞激素代謝過(guò)程金屬離子反應(yīng)、類(lèi)固醇分解過(guò)程、伯醇代謝過(guò)程等生物過(guò)程中，在分子功能方面，主要涉及趨化因子活動(dòng)、氧化還原酶活性、趨化因子受體結(jié)合等，細(xì)胞組成主要影響細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物、蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等。

圖5 GO富集功能分析柱狀圖(CC富集結(jié)果)Fig.5 Histogram of GO enrichment function analysis(CC enrichment results)

圖6 GO富集功能分析柱狀圖(BP富集結(jié)果)Fig.6 Histogram of GO enrichment function analysis(BP enrichment results)

圖8 KEGG富集通路氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway注：圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；圓點(diǎn)顏色越紅，P值越??；逍遙散治療HCC的關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路信息。Note:The larger the dot,the greater the number of enriched genes.The redder the dot,the smaller the P value;Pathway information on the involvement of key targets of Xiaoyaosan in the treatment of HCC.

2.6 KEGG富集通路分析結(jié)果

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，27個(gè)交集靶點(diǎn)基因顯著富集在17條通路上(P<0.05，F(xiàn)DR<0.01)，見(jiàn)圖8，其中最有意義的10條通路包括細(xì)胞衰老信號(hào)通路、甾類(lèi)激素生物合成信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、化學(xué)性致癌信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、視黃醇新陳代謝信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450信號(hào)通路、代謝細(xì)胞色素P450的外源性物質(zhì)信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路，提示逍遙散通過(guò)作用以上多條通路來(lái)發(fā)揮治療HCC的作用。

2.7 逍遙散核心成分作用于CYP1A2、PTGS2和CDK1的分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)“逍遙散有效成分—靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析可知，山奈酚、槲皮素與β-谷甾醇是逍遙散作用于HCC最為關(guān)鍵的核心成分，CYP1A2、PTGS2和CDK1不僅作為疾病的靶點(diǎn)，也同樣出現(xiàn)在最終所得的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)之中且度值較高。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示槲皮素與CYP1A2和PTGS2，β-谷甾醇與PTGS2和CDK1，山奈酚與PTGS2和CYP1A2的分子對(duì)接結(jié)合能均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0 kJ/mol，由此表明二者之間具有較好的結(jié)合活性，結(jié)果見(jiàn)表3和圖9～14。

表3 逍遙散中部分核心活性成分與CYP3A4、PTGS2和CDK1的結(jié)合能

圖9 槲皮素-PTGS2Fig.9 Quercetin-PTGS2

圖10 β-谷甾醇-PTGS2Fig.10 β - sitosterol-PTGS2

圖12 β-谷甾醇-CDK1Fig.12 β-Sitosterol-CDK1

圖13 山奈酚-CYP1A2Fig.13 Kaempferol-CYP1A2

圖14 山奈酚-PTGS2Fig.14 Kaempferol-PTGS2

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)分析大數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行藥物研究的新模式。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與傳統(tǒng)的中醫(yī)藥有機(jī)結(jié)合，其整體性、系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論相一致[10]。使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中藥復(fù)方的作用機(jī)制是當(dāng)下藥理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)[11]。逍遙散具有疏肝解郁，養(yǎng)血健脾，調(diào)和肝脾之功，是和解劑的代表方之一，臨床中常用以治療原發(fā)性肝癌。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，初步挖掘、分析逍遙散在干預(yù)HCC中多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療機(jī)制。

本研究分析了原發(fā)性肝癌與正常人相比其致癌的差異基因，得到明顯影響和改變的基因共580個(gè)，其中上調(diào)基因280個(gè)，下調(diào)基因413個(gè)，并將此作為疾病干預(yù)的靶基因。接著系統(tǒng)分析了逍遙散6味中藥(柴胡、白芍、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓)的有效成分，構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等是有效成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵。槲皮素是甘草中的有效成分，β-谷甾醇是當(dāng)歸中的有效成分，山柰酚是甘草中的有效成分。已有研究表明，槲皮素具有良好的抑制細(xì)胞增殖，調(diào)控血管新生的作用，能夠抑制體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)生長(zhǎng)[12]；具有抗腫瘤，抑制Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲及血管新生[13]，下調(diào)VEGF[14]的作用；同時(shí)還可以降低毛細(xì)血管脆性、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量等。β-谷甾醇主要是抑制血管新生，其通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，對(duì)H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[15]，還能夠調(diào)節(jié)人肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡[16]。山柰酚是一種有抗炎、抗氧化作用的黃酮類(lèi)化合物；具有明顯的抗腫瘤作用，高攝入山柰酚可降低晚期大腸腺瘤的復(fù)發(fā)，體外實(shí)驗(yàn)表明山柰酚對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16具有增殖抑制作用[17]；還能通過(guò)抑制銅離子誘導(dǎo)低密度脂蛋白氧化，成為氧化低密度脂蛋白，能降低單核巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白的表達(dá)，阻止該細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白的攝取，有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。除此之外，化合物中的多個(gè)成分具有抑制血管生長(zhǎng)、減低細(xì)胞侵襲力、下調(diào)VECF表達(dá)等抗腫瘤機(jī)制作用。

對(duì)逍遙散的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如TP53、HSP90AB1、HSP90AA1、VCP、TOP2A、ITGA4、VCAM1、ESR1、HSPA8、MDM2等。研究將有效成分中的核心成分槲皮素、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶基因進(jìn)行了分子對(duì)接驗(yàn)證，證明了其具有良好的親和力，進(jìn)一步佐證了本次研究的科學(xué)性。為了說(shuō)明作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。發(fā)現(xiàn)逍遙散能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞激素代謝、細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶全酶復(fù)合物、趨化因子活性及受體結(jié)合、激素代謝等功能，大多數(shù)基因富集到了與癌癥有直接或間接關(guān)系的通路上，包括甾體激素生物合成通路、P53信號(hào)通路、細(xì)胞衰老通路、化學(xué)致癌通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、視黃醇代謝通路、藥物代謝-細(xì)胞色素p450通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路等。已有研究表明P53信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、活化凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其通路中的p53蛋白大量表達(dá)時(shí)，可以上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平、下調(diào)Bax的表達(dá)來(lái)共同完成細(xì)胞凋亡的調(diào)控[18]。Zhu等[19]發(fā)現(xiàn)TNF信號(hào)通路激活時(shí)可提高了人肝癌細(xì)胞株MHCC-97L中的VEGF及MMP9的表達(dá)，使得癌細(xì)胞的侵襲能力得到增強(qiáng)。據(jù)此，可以推斷逍遙散可能通過(guò)抑制該通路來(lái)達(dá)到延緩HCC發(fā)生發(fā)展的目的。IL-17通路是一條與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在抗腫瘤治療中同樣發(fā)揮著重要作用。當(dāng)IL-17通路被激活時(shí)，荷瘤小鼠體內(nèi)的 MHCⅠ、MHCⅡ和LFA-1大量表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了IFN-γ、IL-12的分泌、進(jìn)而發(fā)揮CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[20]。

已有研究表明逍遙散能夠抑制實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)，并且對(duì)荷瘤造成的脾和胸腺指數(shù)具有一定的恢復(fù)作用[21]；通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，誘導(dǎo)肝癌 SMMC-7721細(xì)胞凋亡[22]；提高機(jī)體免疫功能和調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)[23]；抑制MCF-7的細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡等[24]。但對(duì)于其所影響的具體蛋白，具體信號(hào)通路的研究尚少，根據(jù)本次研究分析結(jié)果可以推斷其影響與肝癌直接或間接相關(guān)的蛋白及通路對(duì)肝癌組織進(jìn)行抑制，從而達(dá)到一定的治療目的。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究了逍遙散多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜機(jī)制過(guò)程，對(duì)進(jìn)一步理解藥物—靶點(diǎn)相互作用機(jī)制提供了重要信息，為后續(xù)從逍遙散中提取有效藥物成分治療HCC提供了依據(jù)，也對(duì)未來(lái)論證中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的科學(xué)性提供了參考。