川麥冬須根總黃酮和總皂苷提取和富集工藝研究

劉曉梅，李沛霞，甘藍(lán)湘，晉 艷，黃 毅，江洪波，金 虹*

1四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，綿陽 621000；2西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010；3成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137

川麥冬，又名“綿麥冬”或“涪城麥冬”，為百合科植物麥冬(Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl)的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心的功效。臨床多用于治療肺燥干咳、喉痹咽痛和腸燥便秘等癥狀[1]?，F(xiàn)代研究表明，麥冬主要化學(xué)成分為甾體皂苷、黃酮和多糖等，具有降血糖、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[2-5]，本課題組在前期研究中還發(fā)現(xiàn)麥冬須根的皂苷及黃酮提取組分對小鼠肺部氣道損傷具有明顯的保護(hù)作用[6]。

目前市售麥冬主產(chǎn)于四川、浙江和江蘇等地，其中川麥冬產(chǎn)量最大。中國藥典規(guī)定麥冬藥用部位為塊根。采摘加工1 000 kg塊根會產(chǎn)生300 kg須根，后者在加工過程中作為非藥用部位被棄用，造成極大的資源浪費(fèi)[7]。近年來，很多研究顯示，麥冬須根的主要活性成分、安全性與塊根相似，其中總皂苷、多糖等含量還明顯高于麥冬塊根[8-12]。2019年4月，四川省發(fā)布了《麥冬須根食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)》[13]，將川麥冬須根正式列為新食品資源，顯示出極大的食用開發(fā)價值和應(yīng)用前景。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報道麥冬的提取工藝[14,15]，而有關(guān)川麥冬須根的提取富集工藝尚未見相關(guān)報道。本研究以國內(nèi)麥冬最大的種植基地—四川三臺縣的川麥冬須根為研究對象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化總皂苷及總黃酮提取工藝，并進(jìn)一步通過大孔樹脂富集這兩類組分，為后續(xù)川麥冬須根資源的合理利用和新產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川麥冬須根：2019年4月采集于四川省綿陽市三臺縣花園鎮(zhèn)川麥冬種植基地；魯斯可皂苷元和蘆丁對照品(純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)；正丁醇、無水乙醇、高氯酸、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純，成都科龍化學(xué)品有限公司)；9種大孔吸附樹脂(D101、AB8、DM301、DA201、H103、HPD100、D3520、HP20和H1020，蚌埠市天星樹脂有限責(zé)任公司)；純水為實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(Sartorius BP121s，德國Sartorius公司)；紫外-可見分光光度計(UV-1100型，中國上海天美科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，中國上海亞榮生化儀器廠)；離心機(jī)(D1008E，美國賽洛捷克有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮和總皂苷含量測定

1.3.1.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考Xu等[16,17]的方法制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取蘆丁對照品溶液(0.2 mg/mL)1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各補(bǔ)加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，并放置6 min后，加氫氧化鈉試液10 mL，再補(bǔ)加水至刻度，搖勻放置15 min，對照空白溶液在500 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(X，mg/mL)與吸光度(Y)的線性回歸方程Y=10.116X-0.014 4(R2=0.999 9)，結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.016 3～0.081 4 mg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin solution

1.3.1.2 總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考2015版中國藥典[1]麥冬項下方法制作魯斯可皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取魯斯可皂苷元對照品溶液(50 μg/mL)0.5、l、2、3、4、5和6 mL，分別置具塞試管中于水浴下?lián)]干溶劑，加人高氯酸10 mL，搖勻，置熱水中保溫15 min，冷卻后對照空白溶液，在397 nm波長處測定吸光度。以魯斯可皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(X，mg/mL)與吸光度(Y)的線性回歸方程Y=0.016X-0.006 6(R2=0.999 3)，結(jié)果表明魯斯可皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品溶液在2.5～30 μg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖2 魯斯可皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ruscogenin standard solution

1.3.2 提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 浸膏得率及提取率測定

麥冬須根浸膏得率和黃酮(或皂苷)的得率采用公式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：C為提取液中黃酮(或皂苷)的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M1為浸膏質(zhì)量，g；M2為麥冬須根樣品的質(zhì)量，g。

1.3.2.2 單因素試驗

以黃酮和皂苷總得率為指標(biāo)，對乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)四個因素進(jìn)行考察，為后面響應(yīng)面法優(yōu)化工藝確定各參數(shù)范圍。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，在固定其余參數(shù)情況下，考察了乙醇濃度：0%、20%、40%、60%、80%和100%；料液比(質(zhì)量比體積)：1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶20；提取時間：0.5、1、1.5、2和2.5 h；提取次數(shù)：1、2、3、4和5次。

1.3.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Design Expert V8.0.6.1軟件，以皂苷和黃酮的總得率為響應(yīng)值，以乙醇濃度、液料比、提取時間和提取次數(shù)為因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化以便篩選最優(yōu)提取條件。試驗設(shè)計因素水平見表1。在獲得最佳工藝條件后，結(jié)合實際應(yīng)用修正工藝參數(shù)并進(jìn)行三次驗證試驗。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表

1.3.3 大孔樹脂富集

1.3.3.1 樹脂篩選

取提取液，加入等體積無水乙醇，渦旋混勻，10 000 rpm離心30 min，取上清液旋至無醇味，加水溶解并通過0.45 μm濾膜過濾，即為上樣液。

分別稱取按說明書預(yù)處理后的9種大孔樹脂各2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL上樣液，于恒溫?fù)u床(25 ℃，180 rpm)振蕩吸附12 h，取出濾液，測定濾液中黃酮和皂苷的含量，并按照公式(3)計算吸附率。將充分吸附后的9種樹脂分別置于100 mL具塞錐形瓶中，各加入30 mL無水乙醇，于恒溫?fù)u床(25 ℃，180 rpm)振蕩解析12 h，取出濾液，測定濾液中黃酮和皂苷的含量，并按照公式(4)計算解吸率。

(3)

(4)

式中：C0為起始樣品液中皂苷(或黃酮)質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附12 h后濾液中皂苷(或黃酮)質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中總皂苷(總黃酮)質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為樣品液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.3.3.2 最優(yōu)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)摸索

取預(yù)處理好的大孔樹脂10 g，濕法裝柱，蒸餾水洗至無色，再分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇溶液洗脫，流速為3.0 mL/min，洗脫體積為6個柱床體積(BV)，收集洗脫液，測定其總黃酮和總皂苷含量，計算解吸率，篩選最優(yōu)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3.3 總皂苷和總黃酮的富集

稱取預(yù)處理好的大孔樹脂10、20和50 g，濕法裝柱，上樣吸附至飽和，蒸餾水洗至無色，再按上述最佳洗脫條件進(jìn)行洗脫，收集洗脫液測定總黃酮和總皂苷含量，并計算純度和回收率，驗證工藝效果和穩(wěn)定性。

(5)

(6)

式中：C1為富集前黃酮(或皂苷)質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為富集前溶液體積，mL；C2為富集后總黃酮(或總皂苷)質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為富集后定容體積，mL；M為富集后樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)三次，采用Excel 2010、SPSS 20.0和Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對黃酮和皂苷總得率的影響

當(dāng)乙醇濃度在0～80%時，麥冬須根中黃酮和皂苷總得率隨乙醇濃度的增大而增加(圖3)。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加后，總得率反而降低，這可能是因為乙醇濃度過大，會使部分醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，影響黃酮和皂苷的總提取效率。方差分析結(jié)果表明，60%與80%、100%之間沒有顯著性差異，其余各水平之間均有顯著性差異。因此，選擇乙醇濃度70%、80%、90%為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

圖3 乙醇濃度對皂苷和黃酮總得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the total yield of saponins and flavonoids 注：料液比1∶20;提取1 h;提取1次。Note:Solid-liquid ratio is 1∶20;Extraction time is 1 h;Extraction times is one time.

圖4 料液比對皂苷和黃酮總得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the total yield of saponins and flavonoids 注：乙醇濃度為100%;提取1 h;提取1次。Note:Ethanol concentration is 100%;Extraction time is 1 h;Extraction times is one time.

2.1.2 料液比對黃酮和皂苷總得率的影響

由圖4可知，隨著溶劑體積的增加，麥冬須根中黃酮和皂苷總得率逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶12(g/mL)時，其總得率趨于平衡，再增加溶劑體積，黃酮和皂苷的得率變化不大。方差分析結(jié)果表明，料液比1∶12與1∶15、1∶20之間，1∶15與1∶20之間沒有顯著性差異，其余各水平均有顯著性差異。因此，選擇料液比1∶10、1∶12、1∶15(g/mL)為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.1.3 提取時間對黃酮和皂苷總得率的影響

由圖5可知，隨著熱回流時間的增加，黃酮和皂苷總得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)提取時間達(dá)到1.5 h時，其總得率最高，但隨著時間的延長，黃酮和皂苷類物質(zhì)穩(wěn)定性變差，會導(dǎo)致得率降低。方差分析結(jié)果表明，0.5 h與1 h之間，1.5 h與2 h、2.5 h之間，2 h與2.5 h之間沒有顯著性差異，其余各水平均有顯著性差異。因此，選擇熱提取時間為1、1.5、2 h為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

圖5 提取時間對皂苷和黃酮總得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the total yield of saponins and flavonoids注：乙醇濃度為100%;料液比1∶10;提取1次。 Note:Ethanol concentration is 100%;Solid-liquid ratio is 1∶10;Extraction times is one time.

圖6 提取次數(shù)對皂苷和黃酮總得率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the total yield of saponins and flavonoids 注：乙醇濃度為100%;料液比1∶10;提取1 h。Note:Ethanol concentration is 100%;Solid-liquid ratio is 1∶10;Extraction time is 1 h.

2.1.4 提取次數(shù)對黃酮和皂苷總得率的影響

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，黃酮和皂苷總得率逐漸升高。方差分析結(jié)果表明，2、3、4、5次之間均沒有顯著性差異，1次與2、3、4、5次之間均有顯著性差異，說明次數(shù)為2時，其總得率趨于平衡，再增加提取次數(shù)，其總得率沒有顯著性增加。因此，選擇提取次數(shù)1、2、3次為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.2 麥冬須根總黃酮和總皂苷提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)為因素，以皂苷和黃酮的總得率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗，共計29組試驗點，響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與試驗結(jié)果

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到總得率Y與A、B、C、D二次多項式回歸方程為Y=2.18+0.12A+0.062B+0.017C+0.16D+0.054AB+0.045AC+0.067AD-0.074BC-0.020BD+0.01CD-0.21A2-0.033B2-0.066C2-0.060D2。

對表2中的試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，該模型極顯著(P<0.01)，其中R2=0.9485，表明模型響應(yīng)值變化的94.85%來自考察的變量?；貧w方程失擬項F=4.05，P=0.095 1>0.05，失擬項不顯著，說明該方程對試驗擬合情況好，誤差小，表明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化麥冬須根中總皂苷和總黃酮的提取工藝是可行的。由F值可知，各因素對皂苷和黃酮總得率影響大小順序為提取次數(shù)(D)>乙醇濃度(A)>液料比(B)>提取時間(C)，且一次項A、B、D對總含量的影響極顯著，C影響不顯著；二次項中A2對總含量影響極顯著，C2、D2影響顯著，其余不顯著；交互項中AD、BC對總含量影響顯著，其余不顯著。

表3 模型方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析

通過Design-Expert V8.0.6.1軟件處理，得到兩因素間的交互作用響應(yīng)面分析圖，見圖7～12。響應(yīng)面坡度越陡峭，說明響應(yīng)值對于該因素的改變越敏感，而曲面坡度越平滑，該因素對響應(yīng)值的影響也就越小。圖7、8、11、12曲面較平滑，說明該兩因素之間交互作用影響不顯著。圖9和圖10的響應(yīng)面坡度陡峭，說明該兩因素之間交互作用影響顯著，該結(jié)果與表3分析結(jié)果一致。

圖7 乙醇濃度(A)和料液比(B)對麥冬須根中黃酮和皂苷總得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and solid-liquid ratio (B) on the total yield of saponins and flavonoids

圖8 乙醇濃度(A)和提取時間(C)對麥冬須根中黃酮和皂苷總得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.8 Contour map and response surface plot showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and extraction time (C) on the total yield of saponins and flavonoids

圖9 乙醇濃度(A)和提取次數(shù)(D)對麥冬須根中黃酮和皂苷總得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.9 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

圖10 料液比(B)和提取時間(C)對麥冬須根中黃酮和皂苷總得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.10 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different solid-liquid ratio (B) and extraction time (C) on the total yield of saponins and flavonoids

圖11 料液比(B)和提取次數(shù)(D)對麥冬須根中黃酮和皂苷總得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.11 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different solid-liquid ratio (B) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

圖12 提取時間(C)和提取次數(shù)(D)對麥冬須根中黃酮和皂苷總含量提取的影響Fig.12 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different extraction time (B) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

2.3 最佳提取工藝條件的驗證試驗

由試驗和分析數(shù)據(jù)預(yù)測，熱回流提取麥冬須根中總皂苷和總黃酮最佳條件為：乙醇濃度為85.372%，料液比1∶15，提取1.4 h，提取3次，此條件下皂苷和黃酮總含量2.35%。這里需要注意一個問題，3次提取次數(shù)與單因素實驗結(jié)果(2次)不一致，這主要是因為單因素實驗限定了其它參數(shù)范圍，沒有考慮相互作用。實驗最終結(jié)果2.35%也高于單因素實驗的最高結(jié)果2.27%，說明響應(yīng)面優(yōu)化更有效。

按照優(yōu)化工藝條件，結(jié)合實際應(yīng)用，將熱回流最佳參數(shù)修正為：乙醇濃度為86%、料液比1∶15、提取1.4 h、提取3次，實驗結(jié)果見表4。浸膏得率為26.17%，總黃酮和總皂苷平均得率分別為0.46%和1.95%，總得率為2.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.90%，與理論預(yù)測值2.35%的偏差為2.60%，小于5%，說明建立的模型預(yù)測性良好，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證試驗結(jié)果

2.4 大孔吸附樹脂的篩選

對9種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸試驗結(jié)果見表5。在吸附率上，D101、AB-8和H103排名前三，這三種樹脂對黃酮和皂苷均表現(xiàn)很好的吸附效果；而在洗脫過程中，D101型樹脂對黃酮和皂苷均表現(xiàn)出很好的解吸效果。綜合吸附率與解吸率兩項指標(biāo)，本研究選用D101大孔樹脂富集純化麥冬須根中的黃酮和皂苷。

2.5 大孔樹脂富集結(jié)果

2.5.1 洗脫劑濃度

圖13所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，D101大孔樹脂對黃酮和皂苷解吸率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，解吸率達(dá)到最高。繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率趨于平衡。由于洗脫劑對黃酮和皂苷類化合物的解吸效果基本具有一致性，所以不易通過分段洗脫分別收集總皂苷和總黃酮部分，故選取最優(yōu)洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

表5 9種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解吸率

圖13 洗脫劑濃度對解吸率的影響Fig.13 Effect of eluent concentration on desorption ratio

2.5.2 富集工藝放大驗證

選取D101大孔樹脂，濕法裝柱，蒸餾水洗至無色，再以70%乙醇溶液洗脫，流速為2.0 mL/min，洗脫體積5 BV。結(jié)果表明，經(jīng)過不同樹脂量的大孔樹脂柱富集后，黃酮和皂苷純度達(dá)到12.18%和45.74%，相對于提取液(黃酮純度1.77%，皂苷純度4.85%)分別提高了約7倍和9倍，回收率也分別達(dá)到了88.69%和90.28%，說明D101富集結(jié)果穩(wěn)定可行。

表6 富集工藝試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

Yin等[18]、Chen等[19]報道了麥冬塊根中總黃酮提取率為0.13%和0.23%，Li等[14]報道總皂苷提取率為0.23%，這些文獻(xiàn)僅考察了單一組分的提取，并沒有考察同時提取黃酮和皂苷，目前也無文獻(xiàn)報道川麥冬須根中這兩種組分的提取工藝。本實驗首次對川麥冬須根的總黃酮和總皂苷提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對麥冬須根中總黃酮和總皂苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)86%、料液比1∶15、提取1.4 h、提取3次。在此條件下，總黃酮得率0.46%，總皂苷得率1.95%，結(jié)果均優(yōu)于上述文獻(xiàn)。

大孔樹脂對活性成分的富集和分離有較好的效果，可同時針對不同類型化合物的分離[20]。本試驗中的總黃酮和總皂苷具有洗脫一致性而不易分開，該結(jié)果在一些文獻(xiàn)中也有報道[21]，這可能與大孔樹脂品種及樣品差異有很大關(guān)系。本試驗通過比較9種不同型號大孔樹脂對麥冬須根黃酮和皂苷的靜態(tài)吸附和解析性能，選擇D101大孔樹脂作為富集樹脂，洗脫劑為70%乙醇、洗脫流速為2 mL/min、洗脫劑用量5 BV。富集后總黃酮和總皂苷回收率達(dá)到88.69%和90.28%，純度相比浸膏分別提升7倍和9倍。利用這套參數(shù)，實驗組在后續(xù)的30 kg級別的中試上也取得了相似的結(jié)果，顯示該工藝對川麥冬須根中最具價值的黃酮和皂苷類有效組分的提取富集效果，操作簡單且穩(wěn)定性好，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，對于川麥冬須根這一新食品資源的開發(fā)利用提供了重要的有效途徑。