復合酶法降低煙草薄片刺激性的研究

徐菲菲 田海龍 李東亮 王迅鍵 陳茂深 李玥 鐘芳

摘要：針對引起煙草薄片刺激性的果膠、蛋白質等大分子前體物，采用酶制劑進行降解。酶解最優(yōu)條件為蛋白酶用量為300 U/g，果膠酶用量為400 U/g，酶解時間為4 h?？疾焱瑫r酶解（PP）、先蛋白酶后果膠酶（PrE-PE）、先果膠酶后蛋白酶（PE-PrE）等3種酶解方式對薄片品質的影響。酶解后提取率均得到提高，PE-PrE處理可以獲得最高的提取率。酶解后熱重性質主要變化為纖維、果膠等大分子物質裂解失重效果減小，燃燒階段失重效果變大。煙氣常規(guī)考察發(fā)現(xiàn)，除PP處理外，2種分步酶解處理方式的總粒相物、焦油含量均有所下降;3種酶解方式的一氧化碳、煙堿含量降低，煙氣水分和抽吸口數(shù)上升。氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析結果表明，經PrE-PE、PE-PrE、PP處理后，香氣成分總量分別增加22%、9%、16%。感官評吸結果表明，PrE-PE處理感官品質最優(yōu)，PE-PrE處理感官品質較差。綜合各個指標，PrE-PE處理最優(yōu)，可以在降低刺激性的同時，得到較好的煙氣品質。

關鍵詞：煙草薄片;復合酶法;刺激性;感官評定;酶解;香氣成分

中圖分類號： TS201.2+5;TS426? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0227-07

煙草薄片（reconstituted tobacco，簡稱RT）是利用煙梗、煙末、碎煙片等卷煙生產過程中的廢棄物，外加植物纖維，經過重新組合而成的產品，也稱為再造煙葉。20世紀90年代末，我國才開始對造紙法煙草薄片進行系統(tǒng)研究。與國外產品相比還有一定差距，主要表現(xiàn)在干燥感嚴重，刺激性較大，煙氣不協(xié)調，木質氣嚴重[1];雖然焦油等有害成分較低，但一氧化碳含量偏高[2]。蛋白質和果膠是煙末和煙梗中含量較高、對吸味及危害性影響較大的2種大分子物質。果膠含量過高時，在干燥環(huán)境下薄片易碎，果膠裂解時還會產生甲醇、甲醛、甲酸等，增加了煙氣刺激性，也不利于安全性。蛋白質燃燒則會產生燒焦羽毛的氣味，產生雜氣，蛋白質也是氨氣的重要前體物，易增加煙氣刺激性。這些問題限制著薄片在卷煙產品中的應用，要提升其感官品質，煙氣干燥感和刺激性是必須解決的兩大直接而突出的問題。

由于高效、綠色環(huán)保的優(yōu)勢，酶和生物技術在這方面發(fā)揮著越來越大的作用。于建軍等利用不同用量果膠酶處理湖北C3F等級煙葉，發(fā)現(xiàn)果膠酶用量越大，果膠去除率越高，可達15%;而總糖含量顯著升高，苯甲醇、苯乙醇等煙葉中重要的致香成分含量顯著升高，致香成分總量升高29.94%，有利于煙葉香氣質量改善[3-4]。韋杰等通過采用4種酶復合優(yōu)化工藝處理煙末制備浸膏，發(fā)現(xiàn)處理后的浸膏中還原糖含量增加123%，氨基酸含量增加74%，膏煙氣濃度和勁頭明顯增加，煙氣柔和細膩，有潤感和甜感，煙香豐富，有烘烤香和果甜[5]。但是現(xiàn)有研究多側重于單純的酶解條件的優(yōu)化及香氣物質的提升，卻缺少對酶解產物其他方面性質，尤其是主流煙氣刺激性成分及有害成分變化的考察。將酶應用于薄片的研究多見于對原料或成品涂布液的處理，缺少結合薄片生產工藝進行酶解研究，在萃取時進行處理的研究還較少見[6]。

本研究結合煙草薄片生產工藝，在煙末萃取過程中進行酶解。選擇果膠酶、中性蛋白酶進行試驗，考察酶用量、酶解時間、酶解方式等對酶解效果及所制備薄片感官品質的影響。進一步考察不同酶解方式對煙草薄片主流煙氣常規(guī)成分、主流煙氣揮發(fā)性物質含量（羰基化合物、氨氣、一氧化碳）、感官品質與燃燒裂解性能的影響。最后，綜合各個指標得出最優(yōu)酶解工藝，以期為實際生產中進一步提升薄片品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中性蛋白酶，活性為61 500 U/mL[諾維信（中國）生物技術有限公司];果膠酶，活性為 40 000 U/g（上海創(chuàng)賽科技有限公司）;煙梗、煙末（山東瑞博斯煙草有限公司）;乙酸苯乙酯、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、糠醛、糠醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-二氫大馬酮、β-紫羅蘭酮、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛等（分析純，北京百靈威科技有限公司）;二氯甲烷、乙腈等為色譜純，氯化鈉、高氯酸、無水硫酸鈉、2，4-二硝基苯肼、異丙醇、吡啶等為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）;劍橋濾片[博瓦特凱希（中國）有限公司];有機濾膜，孔徑為0.45 μm（上海興亞凈化材料廠）。

1.2 主要儀器

HP6890A/5975C氣質聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司）;STA449C熱重分析儀（德國耐馳公司）;同時蒸餾萃取儀（鄭州煙草研究院）;Dionex Ultimate 3000液相色譜儀（戴安中國有限公司）;RM200A吸煙機[博瓦特凱希（中國）有限公司）]。以上儀器由安徽中煙工業(yè)有限責任公司技術中心提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白酶與果膠酶同時酶解正交試驗 選擇蛋白酶用量（200、300、400 U/g）、果膠酶用量（300、400、500 U/g）和酶解時間（2、3、4 h）進行正交試驗，考察提取率和感官評吸得分。

1.3.2 3種不同的酶解方式 （1）果膠酶、蛋白酶同時酶解（PP）：取一定量煙末于錐形瓶中，按照料液比 1 ∶10 加入一定量去離子水，蛋白酶用量為 300 U/g，果膠酶用量為400 U/g，50 ℃酶解2 h，取出后在90 ℃水浴鍋中加熱15 min滅酶，取出后用流水冷卻，以5 000 r/min離心3 min。（2）先用蛋白酶處理，后用果膠酶處理（PrE-PE處理）：用1 mol/L氫氧化鈉溶液將初始pH值調為6.5，加入200 U/g的蛋白酶，50 ℃酶解3 h后取出，在90 ℃水浴鍋中加熱 15 min 滅酶。冷卻后用1 mol/L鹽酸調節(jié)初始pH值為5.8，加入400 U/g果膠酶，50 ℃酶解時間為3 h，取出后于90 ℃水浴中加熱15 min滅酶，以 5 000 r/min 離心3 min。（3）先用果膠酶處理，后用蛋白酶處理（PE-PrE處理）：先用400 U/g果膠酶于50 ℃水浴中酶解3 h，之后90 ℃水浴下滅酶 15 min，冷卻后用 1 mol/L 氫氧化鈉調節(jié)pH值至6.5，加入200 U/g蛋白酶，50 ℃酶解3 h，然后在 90 ℃ 水浴中加熱 15 min 滅酶，以5 000 r/min離心3 min。

比較相關指標性質時，空白樣品采用工業(yè)生產時的萃取條件，萃取結束后取出，于90 ℃水浴中加熱15 min，以5 000 r/min離心3 min。

1.3.3 酶解制備涂布液的涂布與單料煙制備 將不同酶解處理的酶解液濃縮至固形物含量40%左右，稀釋至一定體積，以35%的涂布率噴涂于片基，50 ℃烘干。所得薄片于22 ℃、相對濕度為60%條件下平衡48 h后，用打煙器將其卷制為每支質量為 0.87 g 的薄片單料煙。然后放置于22 ℃、相對濕度為60%的條件下平衡。

1.3.4 酶解涂布液單料煙的感官評吸 參照 YC/T 498—2014《再造煙葉（造紙法）感官評價方法》進行感官評吸，評價項目有香氣質、香氣量、混濁、煙氣濃度、細膩度、木質氣、其他雜氣、刺激、灼燒、純凈度、舒適度、干燥感等。請10位專家級評價員對每項感官指標進行打分，以0.5分為計算單位，每項滿分為10分，總分為120分。

1.3.5 涂布液中中性香氣成分的鑒定 香氣成分的提取采用同時蒸餾萃取法。取40 mL濃縮涂布液至1 000 mL圓底燒瓶中，加入350 mL水和90 g氯化鈉，接于同時蒸餾萃取一端，下裝電熱套加熱。取40 mL二氯甲烷于100 mL圓底燒瓶，放入60 ℃水浴鍋中加熱。調整電熱套加熱功率，使得二氯甲烷開始回流時，樣品溶液恰好開始沸騰，并迅速達到平衡，使分界面保持在“U”形管一側中央位置。加熱2 h后自然冷卻，收集二氯甲烷萃取液。用吸管吸取部分上層水，加入無水硫酸鈉過夜存放12 h。將萃取液轉移至燒瓶，加入30 μL濃度為 0.123 mg/mL 的乙酸苯乙酯溶液作為內標，在50 ℃濃縮至1 mL，有機濾膜過濾后進行氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）分析。GC-MS分析條件參考文獻[7]。

1.3.6 煙草薄片單料煙煙氣常規(guī)成分的測定 按照GB/T 19609—2004《卷煙 用常規(guī)分析用吸煙機測定 總粒相物和焦油》、YC/T 30—1996《卷煙 煙氣氣相中一氧化碳的測定非散射紅外法》、YC/T 156—2001《卷煙 總粒相物中煙堿的測定氣相色譜法》等測定煙草薄片單料煙煙氣常規(guī)成分。

1.3.7 煙草薄片熱失重行為 分析采用熱重分析儀測定薄片的熱失重行為。升溫速率為20 ℃/min，加熱范圍為20～900 ℃，以氮氣、氧氣體積比為 9 ∶1 進行裂解，混合氣體流速為100 mL/min。

2 結果與分析

2.1 復合酶解正交試驗結果

選擇果膠酶用量、蛋白酶用量、酶解時間等3個因素進行優(yōu)化，結果見表1。

極差分析結果見表2，果膠酶用量對提取率影響最大，其次為酶解時間，蛋白酶用量影響最小。由表1可知，以提取率最高為標準，最優(yōu)工藝組合為A3B3C2，即蛋白酶用量為400 U/g，果膠酶用量為500 U/g，酶解時間為3 h?？疾旄泄僭u吸得分可知，影響最大的因素同樣為果膠酶用量，排第2位的因素變?yōu)榈鞍酌赣昧?，酶解時間影響最小。以感官評吸得分最優(yōu)為標準，最優(yōu)工藝組合為A2B2C3，即蛋白酶用量為300 U/g，果膠酶用量為400 U/g，酶解時間為4 h?？梢园l(fā)現(xiàn)，感官品質最優(yōu)對應的工藝條件組合與提取率最優(yōu)時并不相同。隨著提取率上升，酶解程度上升，果膠、蛋白質降解程度加大。如果僅從細胞壁物質降解，刺激性降低角度考慮，感官品質會與提取率變化相一致。但是隨著提取率發(fā)生變化以及酶解條件的不同，酶解液中的可溶性糖、游離氨基酸等成分的含量和比例也會發(fā)生變化。要達到一個較高的感官品質，煙草中糖類、蛋白質、游離氨基酸等成分須要相互協(xié)調，相輔相成，對涂布液來說是同樣的。所以，除了果膠、蛋白質的降解外，成分間比例的協(xié)調也會影響最終的感官品質，從而造成提取率與評吸得分的不一致。以感官品質提升為標準的最優(yōu)條件為蛋白酶用量為 300 U/g，果膠酶用量為 400 U/g，酶解時間為4 h。

2.2 酶解方式對感官評吸及提取率的影響

由表3可知，3種酶解方式處理后，感官評分及提取率大多數(shù)有所提高。其中PrE-PE處理組的感官品質最好，其次為PP處理組。PE-PrE處理的薄片刺激性評分雖然較高，但是其他指標，尤其是香氣指標和純凈度、舒適度均低于其他2組，導致最終評吸總分不高。PE-PrE處理組的提取率最高，另外2個酶處理組沒有明顯差異。

PE-PrE處理的提取率最高，是因為其細胞壁物質降解較為徹底。在多篇關于非淀粉多糖酶與蛋白酶復合降解植物細胞壁物質的文獻中，可以發(fā)現(xiàn)分步酶解可以取得較好的酶解效果，尤其是先用纖維素酶或果膠酶進行處理，再用蛋白酶處理的方式。這主要是由于在植物材料中，纖維素、果膠等多糖與蛋白質相互交織、包埋，用多糖酶將外層多糖酶解后，可以更有利于蛋白酶的進一步降解[8]。

2.3 酶解方式對中性香氣成分的影響

煙葉香氣成分是煙氣香氣質量的基礎[9-10]。不同酶解方式對涂布液香氣成分的影響結果如表4所示。由表4可以看出，3種酶解方式處理后，香氣成分總量都明顯增加。其中，以PP和PrE-PE處理2種方式所得酶解液的香氣成分含量增加最多，分別增加16%、22%。根據香氣成分來源可以將其分為苯丙氨酸降解產物、美拉德反應產物、西柏烷烴降解產物、類胡蘿卜素降解產物等。由結果可知，經過酶解后，涂布液中各類香氣成分均有所增加。其中，又以美拉德反應產物、類胡蘿卜素降解產物、新植二烯等的含量增加最為明顯，對香氣總量的增加貢獻最大。

酶解后，酶解液中可溶性總糖和游離氨基酸、短肽增多，這為酶解和濃縮時發(fā)生美拉德反應提供了豐富的原料。PP和PrE-PE處理所產生的氨基酸和蛋白質比例適宜，反應時間充分，因而產生較多的產物?？梢钥闯?，酶解前后，新植二烯在所選香氣成分中都占有較大比例，這與它在煙草原料中含量最多有關。新植二烯是葉綠素降解產物，雖然其香氣閾值高，香氣不突出。但其裂解后轉化為其他香氣物質，并可以作為其他香氣載體，因此其對卷煙香氣的體現(xiàn)有重要作用[11]。經過酶解后，新植二烯含量有一定程度的升高，這主要是由于酶解過程中細胞壁物質降解，原料組織結構松散，香氣物質易于從原料中轉移到涂布液中。經過酶解后，煙堿含量有一定程度下降，這可能是由于酶解及濃縮過程中，煙堿在加熱或酸堿條件下發(fā)生降解所致。

2.4 酶解方式對煙氣常規(guī)成分的影響

酶解過程影響了涂布液中可燃物總量及其相對比例，可能對薄片的主流煙氣成分產生影響。不同酶處理所得涂布液制備的卷煙的主流煙氣成分見表5，分步酶解樣品的總粒相物、焦油等含量較對照均有降低，同時酶解（PP）處理的樣品則比對照高。

酶解后，由于提取率的增加，涂布液中可溶性糖等成分顯著增加。糖類物質的增加可導致焦油含量上升[12]，因此，在以相同體積涂布時，同時酶解后的涂布液產生了更多焦油。不同于同時酶解，分步酶解的總粒相物、焦油等含量均有所降低，這可能是由于酶解時加入了一定量的氫氧化鈉。加入堿金屬后，其催化裂解燃燒，使得焦油含量降低，殘?zhí)课锖吭黾覽13]。主流煙氣中煙堿由涂布液中的煙堿揮發(fā)而成，由于酶解及濃縮過程中煙堿發(fā)生降解轉化，涂布液中煙堿含量減少，最終反映在煙氣中。酶解之后，一氧化碳含量均有所降低，這與果膠、蛋白質的降解有關。果膠和蛋白質等大分子物質是一氧化碳的重要前體物[2]。而其降低程度的不同則反映出了酶解程度的不同。酶解之后，隨提取率上升，可溶性糖含量上升，3種酶解方式的抽吸口數(shù)均有所增加。同時，水溶性糖含量的增加又使得薄片在標準條件平衡時，平衡含水率上升，這有利于煙氣水分上升。另外，煙氣中近一半的水都來自于有機物的裂解燃燒，而單糖等可溶性糖裂解產生水分的產率較果膠、纖維素等大分子物質高，這也是煙氣中水分增多的重要原因[14]。

2.5 酶解方式對薄片熱失重行為的影響

作為一種特殊的消費品，煙草的品質特征須要通過燃燒體現(xiàn)，而酶解對涂布液成分的改變也會對薄片燃燒性質產生改變。因此，考察不同酶解處理方式對薄片熱失重行為的影響。

薄片的熱重曲線（TG曲線）和一階微商曲線（DTG曲線）如圖1、圖2所示，各個失重區(qū)間的特征參數(shù)見表6。

如之前所述，薄片的熱失重行為分為4個階段：

低溫區(qū)水分及易揮發(fā)物的散失、有機物的裂解、殘?zhí)课镔|的氧化燃燒、結炭過程。不同酶解方式處理后，薄片的熱失重區(qū)間同樣可以劃分為4個，但為突出酶解對單糖及簡單糖裂解的影響，將單糖的裂解從有機物裂解區(qū)間中單獨劃分出，共5個階段。由表6可知，酶解處理對不同熱失重區(qū)間有不同的影響。對于水分及易揮發(fā)物的散失，酶解處理后，熱失重峰值溫度上升，最大熱失重速率減小，失重百分比降低。這主要體現(xiàn)在不同薄片中水分及可燃性有機物含量的相對比例，經過酶解后，可燃性有機物含量升高較水分多，因此水分失重百分比下降。對于第2階段為單糖及簡單糖的裂解，此階段

的失重百分比可以反映出單糖含量的相對比例。酶解之后，隨提取率上升，單糖增多，失重百分比增大。

對于第3階段，空白樣品的纖維、果膠等大分子物質裂解起始溫度最低，為199.3 ℃，酶解之后，起始溫度均升高。說明蛋白質與果膠酶解后，由于在低溫區(qū)裂解的單糖等小分子物質增多，大分子物質裂解起始溫度被推遲。樣品間最突出的差別反映在最大失重速率與失重百分比上。與空白樣品相比，酶解之后，由于可溶性成分增多，果膠等大分子物質失重速率及失重百分比均有所下降。分步酶解效果更大，所以大分子裂解失重下降更多。考察此階段的溫度區(qū)間長度，可以發(fā)現(xiàn)，酶解之后，區(qū)間長度變短?？偟膩碚f，酶解使得纖維、果膠等大分子裂解失重效果減弱。

對于第4階段，即燃燒階段，酶解之后，熱失重百分比均升高，其中，PE-PrE處理升高最多。與裂解階段的變窄不同，燃燒階段顯著變長，分步酶解較同時酶解（PP）增長更多。因此，酶解的進行增大了薄片在殘?zhí)既紵A段的熱失重效果，放大了燃燒反應。

對于第5階段，為結炭過程，在薄片中主要體現(xiàn)為碳酸鈣的分解?？梢园l(fā)現(xiàn)，添加涂布液后，酶解樣品較空白涂布液樣品的失重峰值溫度下降，失重百分比上升，說明酶解的進行增加了碳酸鈣分解失重效果，這可能和燃燒效果增強，所釋放的熱量增多有關。

考察殘留量占比可以發(fā)現(xiàn)，相對于空白涂布液，不同酶解處理對殘留質量影響不同。同時酶解處理后，殘留量下降，分步酶解后，殘留量則上升。除了分步酶解時添加氫氧化鈉增加灰分外，鈉也可能阻礙燃燒階段殘?zhí)课锏难趸紵黾託埩糍|量[15]。

3 討論與結論

本研究結果表明，以感官品質最優(yōu)為評價標準，最優(yōu)工藝組合為蛋白酶用量為300 U/g，果膠酶用量為400 U/g，酶解時間為4 h。PrE-PE處理取得最高感官評分，刺激性評分提升，且有較優(yōu)的香氣和吸味。酶解的增香效果明顯，以PP和PrE-PE處理2種方式所得酶解液的香氣成分增加最多，分別增加16%、22%。酶解之后，各類香氣成分都有所增加，其中又以美拉德反應產物、類胡蘿卜素降解產物、新植二烯等的含量增加最為明顯，對香氣總量的增加貢獻最大。除同時酶解（PP）處理外，2種分步酶解處理方式的總粒相物、焦油含量均有所下降，3種酶解方式的一氧化碳、煙堿含量均降低，煙氣水分和抽吸口數(shù)上升;酶解后羰基化合物和一氧化碳含量顯著降低，尤以分步酶解的降低效果較好。

薄片涂布液萃取過程中加酶酶解可以有效降低大分子物質含量，從而提升涂布液品質，降低羰基化合物、一氧化碳含量，也可以在一定程度上改善薄片香氣。煙氣中羰基化合物產生于3個溫度區(qū)間，分別對應薄片中原有羰基化合物的揮發(fā)、纖維等大分子物質裂解、殘?zhí)嘉镔|的燃燒[16-17]。3個溫度區(qū)間相比，羰基化合物主要產生于裂解區(qū)間，說明羰基化合物主要來自纖維、果膠等大分子物質裂解。酶解后，果膠等大分子物質含量降低，使得煙氣中羰基化合物含量降低。由于分步酶解可以取得更好的降解效果，所以分步酶解的羰基化合物含量降低更多，尤以PE-PrE處理降低最多。熱重分析結果中，大分子物質裂解失重的減弱也說明了這一問題。從溫度范圍考慮，一氧化碳有2個產生區(qū)間：裂解區(qū)和燃燒區(qū)。一氧化碳主要來源于纖維、果膠等大分子物質的裂解，這是薄片與煙葉相比一氧化碳含量較高的原因。經過酶解后，果膠等前體物減少，使得一氧化碳含量降低，降低趨勢與羰基化合物一致，這是因為它們的產生途徑及前體物較相似。

分步酶解可以取得較好的酶解效果，有效降解果膠等大分子物質，從而使得主流煙氣中羰基化合物含量降低。但對于氨氣，不同的加酶順序效果不同。PrE-PE處理可以在酶解和濃縮過程中利用美拉德反應有效降低氨基酸等氨氣前體物，從而使得煙氣中氨氣含量保持在較低水平，最終感官品質較好。而PE-PrE處理則會使煙氣中產生較多氨氣，最終導致感官抽吸品質較差。煙葉、薄片及煙氣中各種成分相互協(xié)調、相互作用，共同構成卷煙的整體吸味。煙葉感官品質的好壞并不取決于某種成分絕對含量。Sun等研究了4個煙區(qū)的陳化煙葉，發(fā)現(xiàn)感官品質與可溶性糖含量呈負相關關系，但主要是由于發(fā)生美拉德反應或裂解反應增加了香氣物質，而不是由于糖直接降低了煙氣品質[15]。因此，在采用酶解技術改善薄片品質時，對各個成分之間協(xié)調性的控制十分關鍵。

致謝：感謝安徽中煙工業(yè)有限責任公司技術中心以及感官評吸專家組的各位評價員對本研究給予的幫助，謹致謝意！

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收稿日期：2019-08-12

基金項目：四川中煙工業(yè)有限責任公司寬窄潤甜香品類構建重大專項[編號：川煙工技（2018）95號];中國煙草總公司山東省公司科技重點項目[編號：魯煙科（2018）10號]。

作者簡介：徐菲菲（1984—），女，吉林吉林人，碩士，實驗師，主要從事煙草化學研究。E-mail：xuff@jiangnan.edu.cn。

通信作者：陳茂深，博士，副教授，主要從事煙草化學研究。E-mail：chenmaoshen@jiangnan.eud.cn。