內(nèi)生菌定殖水稻對稻田土壤中毒死蜱降解的影響

詹紅林 葛靜 程江峰 余向陽

摘要：研究了1株具有毒死蜱降解活性的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）DGB定殖水稻后對水稻及種植土壤中毒死蜱降解的影響。在低濃度和高濃度毒死蜱處理的土壤中，接菌水稻生物量相比對照分別增加了22.1%和173%;在試驗前期接菌水稻中毒死蜱殘留量要顯著高于對照組，后期差異逐漸減小。與對照相比，接菌水稻種植的低與高2個處理土壤中毒死蜱殘留分別減少了27.6%和43.9%，半衰期分別由11 d和10.8 d降至9.6 d和8.1 d。結(jié)果表明，該內(nèi)生菌定殖水稻能夠顯著促進土壤中毒死蜱的降解，同時對水稻生長也有一定的增益。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌;毒死蜱;水稻;土壤;生物修復(fù);農(nóng)藥殘留

中圖分類號： X592? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0278-05

毒死蜱（chlopyrifos）是一種廣譜性有機磷類殺蟲劑。自20世紀(jì)60年代以來，毒死蜱廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市害蟲的防治 [1]。2014年對浙江省紹興市部分蔬菜基地及農(nóng)貿(mào)市場各類蔬菜進行抽檢的結(jié)果中毒死蜱的農(nóng)殘超標(biāo)率達到77.8%，其中以青菜、芹菜等葉菜類蔬菜為主[2]。2016年對江西省內(nèi)16個龍牙百合基地鮮百合進行抽檢，其中毒死蜱的檢出率為10%[3]。已有研究表明，毒死蜱能夠在多種動植物體內(nèi)富集[4]，對人的神經(jīng)系統(tǒng)和腦發(fā)育也有著潛在危害[5-6]，毒死蜱還與癌癥的發(fā)生有關(guān)，長期接觸可能會增加患肺癌的概率[7-8]。毒死蜱在農(nóng)田土壤及水體中的殘留會對地表水和地下水造成污染。稻田系統(tǒng)又是作物系統(tǒng)中比較特殊的一類，稻田農(nóng)藥更容易通過徑流、滲濾等途徑進入到水體環(huán)境中，因此，修復(fù)農(nóng)田環(huán)境中的農(nóng)藥殘留對整個生態(tài)環(huán)境都有非常重要的意義。

生物修復(fù)是一種利用微生物降解污染物的修復(fù)手段，是一種可靠、經(jīng)濟有效的環(huán)境污染治理方法。不同微生物間的合作甚至能夠?qū)⑽廴疚锿耆到?，目前，已?jīng)有利用微生物修復(fù)有機磷農(nóng)藥污染的土壤和水環(huán)境的研究[9]。有些微生物在對污染物進行解毒的同時對植物的生長也能起到一定的促進作用[10-11]。關(guān)于毒死蜱降解菌的研究較多，人們從環(huán)境中已陸續(xù)分離出多株具有降解毒死蜱能力的微生物，如希瓦氏菌屬BT05[12]、腸桿菌屬菌株B-14[13]、蒼白桿菌屬JAS2[14] 等。Maya等從土壤中分離獲得不同菌屬的7株毒死蜱降解菌，它們對毒死蜱的降解能力強弱依次為假單胞菌、農(nóng)桿菌、桿菌[15]。Lakshmi將4株不同屬的毒死蜱降解菌（熒光假單胞菌屬、羊布魯氏桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌）分別接種到50 mg/kg毒死蜱污染的土壤中，30 d后毒死蜱的去除率達到85%～92%，而對照土壤中毒死蜱的去除率僅為34%[16]。趙倩等將1株鄰單胞菌屬降解菌DLL-1接種到含15 mg/kg甲基對硫磷的竹林土壤中，10 d后甲基對硫磷的去除率達到98.8%[17]。但是，在實際應(yīng)用中由于土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的差異經(jīng)常出現(xiàn)接入的降解菌存活率低、降解活性弱等問題。Li等在修復(fù)50 mg/kg毒死蜱污染土壤時發(fā)現(xiàn)在接種糞產(chǎn)堿菌屬毒死蜱降解菌DSP3的同時種植甘藍，土壤中毒死蜱在12 d后完全降解，而未種植植物的土壤中毒死蜱12 d的去除率僅為22%[18]。但是對內(nèi)生降解菌-作物協(xié)作治理農(nóng)田環(huán)境中農(nóng)藥殘留的研究還較少。

本研究通過室內(nèi)盆栽試驗，向土壤中添加不同濃度的毒死蜱，測定內(nèi)生菌定殖水稻后對水稻生物量、植株毒死蜱殘留和土壤毒死蜱殘留的改變，探究內(nèi)生降解菌與水稻協(xié)作對稻田土壤中毒死蜱污染降解的影響。進而分析內(nèi)生降解菌定殖水稻輔助治理稻田系統(tǒng)中毒死蜱殘留的可行性，以期為環(huán)境中農(nóng)藥污染物的原位修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植株與土壤 土壤采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗田，日本晴水稻種子來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。供試菌株為課題組前期從水稻內(nèi)分離出的1株具有毒死蜱降解特性的內(nèi)生菌DGB，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌屬。

1.1.2 主要試劑 97%毒死蜱原藥（南京紅太陽股份有限公司）;99.9%毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實驗科技股份有限公司）;色譜純正己烷（德國Merck公司）;分析純乙腈（德國Merck公司）。

1.1.3 主要儀器 Agilent HP6890氣相色譜（美國安捷倫公司）;WH-3微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;Centrifuge 5804R型離心機（EPPENDORF公司）;JJ223BC 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）;IKA型組織勻漿機（德國IKA儀器設(shè)備有限公司）;

1.2 試驗設(shè)計

土壤于陰涼處晾干后過10目篩，加入一定量毒死蜱混勻后分別獲得含2、20 mg/kg毒死蜱的土壤;將生長狀況相近的3葉1心水稻幼苗隨機分成2組，接菌水稻組置于無菌生理鹽水配制的菌懸液中過夜培養(yǎng)，對照組用等量無菌生理鹽水處理。接菌水稻與對照水稻均單獨移栽至低濃度及高濃度毒死蜱污染的土壤中生長，分別于0、1、3、7、15、30 d測定各處理水稻生物量、水稻植株及土壤中毒死蜱濃度，另測定未種植水稻的毒死蜱污染土壤中毒死蜱殘留變化。每個處理重復(fù)3次。所有試驗于2019年完成于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗水稻種植 水稻種子用3%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，滅菌去離子水洗滌3～5次，75%乙醇浸泡5 min，滅菌去離子水洗滌3～5次。消毒種子30 ℃避光催芽，出芽狀況相近的水稻種子轉(zhuǎn)移至水培系統(tǒng)繼續(xù)培養(yǎng)，生長至3葉1心開始試驗。

1.3.2 樣品中毒死蜱的提取分析 水稻植株：水稻植株整株剪碎加入10 mL乙腈后勻漿機打碎，加入1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，5 000 r/min離心 5 min，取2 mL上清液加入50 mg GCB、100 mg無水硫酸鎂和30 mg PSA，渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液氮氣吹干，加入1 mL色譜級正己烷，過0.22 μm有機系濾膜，待進樣。

土壤：稱取5.0 g土壤加入10 mL乙腈，渦旋振蕩 2 min，加入2.0 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，5 000 r/min 離心5 min，取2 mL上清液加入100 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA，渦旋振蕩2 min，5 000 r/min 離心 5 min，取1 mL上清液氮氣吹干，加入1 mL色譜級正己烷，過0.22 μm有機系濾膜，待進樣。

氣相色譜檢測條件：HP-1701毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;ECD檢測器溫度320 ℃;進樣口溫度280 ℃;柱溫150 ℃，保持1 min，以 15 ℃/min 的速度升至270 ℃，保持5 min;進樣量，1 μL;載氣為N2，流速1 mL/min。該方法下毒死蜱在儀器上的保留時間為8.81 min，在水稻植株樣品中的回收率為106.78%，RSD為6.39%;在土壤樣品中的回收率為95.26%，RSD為4.83%。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌定殖對水稻生物量的影響

接菌與對照水稻在2 mg/kg與20 mg/kg毒死蜱污染的土壤中生長1個月，隨著時間變化各處理水稻生物量的變化如圖1所示。在2 mg/kg毒死蜱污染土壤處理中接菌水稻在7 d時水稻生物量略高于對照處理水稻，到30 d時接菌水稻生物量達到對照組水稻生物量的1.22倍;20 mg/kg污染土壤中對照組水稻在前3 d生物量變化不明顯，到30 d時接菌水稻與對照組水稻生物量也出現(xiàn)較大差距，接菌水稻生物量為對照組的1.17倍。不同濃度毒死蜱污染對水稻生物量變化影響不明顯。

2.2 內(nèi)生菌定殖對水稻植株毒死蜱殘留的影響

2 mg/kg毒死蜱污染土壤中接菌水稻與對照水稻毒死蜱含量變化見圖2。水稻植株內(nèi)毒死蜱含量在開始處理1 d時內(nèi)急劇上升，接菌水稻毒死蜱含量達到了對照組水稻的1.56倍，從7 d時開始2個處理水稻毒死蜱含量差異顯著減小，到15 d時由132倍減至1.13倍，并于30 d時接菌水稻毒死蜱含量與對照水稻基本保持一致。20 mg/kg污染土壤中水稻植株內(nèi)毒死蜱含量變化與2 mg/kg污染土壤相似，1、3、7、15、30 d時樣品中接菌水稻毒死蜱含量分別為對照組的1.40、1.43、1.53、1.33、1.30倍，在7 d時2個處理水稻毒死蜱含量差異最大，隨后差異開始逐漸減小。

2.3 內(nèi)生菌定殖水稻對土壤毒死蜱殘留的影響

土壤中毒死蜱含量變化以未種植水稻的土壤為空白組，種植未接菌水稻的土壤為對照組，種植接菌水稻的土壤毒死蜱含量變化見圖3。30 d時 2 mg/kg 毒死蜱污染處理對照組與接菌水稻組土壤中毒死蜱殘留量分別為空白組的54.92%和3978%;20 mg/kg 毒死蜱處理的結(jié)果較為相似，對照組與接菌水稻組土壤中毒死蜱殘留量分別為空白組的5286%和29.83%。

各處理土壤中毒死蜱降解動態(tài)、相關(guān)系數(shù)和半衰期見表1。2 mg/kg毒死蜱處理空白組、對照水稻組、接菌水稻組土壤中毒死蜱半衰期分別為16.12、11.00、9.63 d;20 mg/kg毒死蜱處理各組土壤中毒死蜱半衰期分別為16.12、10.83、8.06 d?？梢?，2 mg/kg 及20 mg/kg毒死蜱污染的土壤中種植水稻能夠?qū)Χ舅莉绲慕到馄鸬矫黠@的促進作用，內(nèi)生菌定殖水稻則能夠進一步加速土壤中毒死蜱降解速率。

3 討論與結(jié)論

利用內(nèi)生菌與農(nóng)作物協(xié)作修復(fù)農(nóng)田環(huán)境中的農(nóng)藥污染已成為近年來的研究熱點[19]，這可能成為農(nóng)藥污染修復(fù)及保障農(nóng)產(chǎn)品安全的一條有效途徑。本試驗通過降解菌定殖，探究微生物與水稻協(xié)作對土壤中毒死蜱修復(fù)的作用。結(jié)果表明，接菌后有利于種植于毒死蜱污染土壤中水稻生物量的增加，對水稻植株內(nèi)毒死蜱含量檢測結(jié)果表明，接菌后水稻植株內(nèi)毒死蜱的含量在前期要遠高于對照，但到后期差異迅速減小。由此可知，內(nèi)生菌定殖只會在短時間內(nèi)增加水稻內(nèi)的毒死蜱濃度。

低與高濃度毒死蜱處理土壤中種植水稻后對土壤中毒死蜱的去除均有一定的促進作用，當(dāng)水稻接菌后這種促進得到進一步強化。相似的，黃春萍等[20]發(fā)現(xiàn)施用具有毒死蜱降解活性的芽孢桿菌MZS1可同時促進大芥菜與土壤中毒死蜱的降解，且對大芥菜有一定的促生作用。但直接噴施菌液受到環(huán)境中多種因素的影響，效果不是十分穩(wěn)定，降解菌定殖作物則可以極大地避免這些影響。

于毒死蜱污染土壤，結(jié)果表明接菌后對受到毒死蜱脅迫的水稻有著顯著的促生作用，且極大地加快了土壤中毒死蜱的降解速率，而接菌水稻植株內(nèi)毒死蜱含量的上升也僅發(fā)生在短時間內(nèi)。接菌后水稻可以在正常生長的同時加速降解土壤中的農(nóng)藥殘留，因此，內(nèi)生菌與農(nóng)作物協(xié)作修復(fù)農(nóng)田環(huán)境中農(nóng)藥污染問題是可行的。為了更好地利用內(nèi)生菌與作物協(xié)作修復(fù)土壤中有機物污染，仍需進一步研究植物與內(nèi)生菌間的相互作用機制。

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收稿日期：2020-04-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：31872002）。

作者簡介：詹紅林（1994—），男，江西九江人，碩士研究生，主要從事微生物、植物與環(huán)境污染物研究。E-mail：1426417856@qq.com。

通信作者：余向陽，博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)品質(zhì)評價研究，E-mail：yuxy@jaas.ac.cn;程江峰，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)與食品安全研究，E-mail：chengjiangfeng@qust.edu.cn。