雞源乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析

李宏偉 慈百全 侯明磊 羅智文 張瑤 林連兵 張棋麟

摘要：從健康雞腸道中自行分離篩選出9株乳酸菌株為試驗(yàn)菌株，通過(guò)考察菌種的生長(zhǎng)速度、耐酸、耐膽堿、耐腸胃液，并以抑菌性能作為主要指標(biāo)。通過(guò)產(chǎn)酸能力測(cè)定、耐酸能力測(cè)定、耐受腸胃極端環(huán)境性能測(cè)定得到2株乳酸菌，2株乳酸菌上清液經(jīng)牛津杯雙層平板法對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌等5株指示菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2株乳酸菌對(duì)5株指示菌株都具有非常明顯的抑菌作用。采用16s rDNA分子標(biāo)記對(duì)乳酸菌進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，L2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、L4為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

關(guān)鍵詞：雞源乳酸菌;耐受能力;菌株鑒定;抑菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0188-04

收稿日期：2019-08-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31760042、31960286）;云南省教育廳科學(xué)研究基金（編號(hào)：2019J0050）。

作者簡(jiǎn)介：李宏偉（1993—），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槟c道微生物及其高密度發(fā)酵。E-mail：lihongwei667@163.com。

通信作者：張棋麟，副教授，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)基因組學(xué)。E-mail：zhangqilin88888@126.com。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類可以使碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[1];形態(tài)上常分為桿狀和球狀2類，為革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧型細(xì)菌[2];被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中，被公認(rèn)為安全的微生物，可應(yīng)用于醫(yī)療、食品添加和畜牧等行業(yè)[3-5]。乳酸菌是工業(yè)上重要的細(xì)菌，這些細(xì)菌利用各種底物生產(chǎn)發(fā)酵食品和飲料，如牛奶、蔬菜、谷物、肉類、可可豆等。酸奶、奶酪和發(fā)酵乳制品被廣泛認(rèn)為是益生菌的主要來(lái)源[6-7]。益生菌被定義為“活的微生物”，在攝入一定數(shù)量的益生菌后，除固有的基本營(yíng)養(yǎng)外，還能發(fā)揮健康益處[8-9]。益生菌的有益作用包括預(yù)防和治療腹瀉病、預(yù)防感染、管理炎癥性腸病、免疫調(diào)節(jié)等疾病[2，10-11]。本研究從健康雞腸道十二指腸黏膜中分離出優(yōu)質(zhì)的乳酸菌，通過(guò)對(duì)乳酸菌的耐酸、耐膽堿、耐腸胃液能力、產(chǎn)酸能力以及乳酸菌對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果等指標(biāo)測(cè)試評(píng)價(jià)，獲得生長(zhǎng)速率快、耐受極端環(huán)境強(qiáng)、抑菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣的優(yōu)良菌株。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

本試驗(yàn)于2019年3—7月在昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院腸道微生物課題組內(nèi)完成。

1.2材料與試劑

1.2.1菌種乳酸菌從云南特有品種無(wú)量山烏骨雞（Gallus gallus）健康成年雞腸道內(nèi)分離獲得。沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、無(wú)乳鏈球菌為昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院噬菌體與腸道微生物課題組實(shí)驗(yàn)室保存。

供試雞，購(gòu)自云南南澗無(wú)量山烏骨雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2.2培養(yǎng)基與試劑MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.00 g、牛肉粉8.00 g、酵母粉4.00 g、葡萄糖 20.00 g、硫酸錳0.04 g、磷酸氫二鉀2.00 g、檸檬酸氫二銨2.00 g、乙酸鈉5.00 g、硫酸鎂0.20 g、吐溫-80 1.00 g、瓊脂15.00 g，加水至1 L，采用 1 mol/L 鹽酸將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8，121 ℃下滅菌 20 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、瓊脂15 g，加水至1 L，121 ℃下滅菌 20 min。

其他生化試劑：結(jié)晶紫、碘液、乙醇、鹽酸、胰蛋白酶、胃蛋白酶、豬膽鹽等所有生化試劑，均購(gòu)置于上海源葉生物科技有限公司。

1.3主要設(shè)備儀器

落地式超凈工作臺(tái)[邦西儀器科技（上海）有限公司]、酸堿度pH測(cè)定計(jì)（上海佑科儀器表有限公司）、紫外分光光度計(jì)（上海佑科儀器表有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）、臺(tái)式高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、超低溫冰箱（日本三洋電器股份有限公司）。

1.4方法

1.4.1雞腸道中乳酸菌的分離和純化取健康雞腸道，采用無(wú)菌生理鹽水清洗雞腸道并刮去腸道內(nèi)容物，在腸黏膜表層不同位置刮取黏液，置于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)12 h[12]。將菌液取 100 μL 涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上（含5% CaCO3），37 ℃下培養(yǎng)24 h[13]。挑取生長(zhǎng)最為旺盛且具有透明溶鈣圈的單菌落繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，將產(chǎn)生溶鈣圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，革蘭氏染色陽(yáng)性菌株初步定為乳酸菌，將上述菌株用含有15%甘油的MRS培養(yǎng)基保存于-80 ℃。

1.4.2菌株產(chǎn)酸分析將上述純化后的菌株，取200 μL接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)24 h，使用分光光度計(jì)檢測(cè)乳酸菌在600 nm處的吸光度，并使用pH計(jì)檢測(cè)其pH值。

1.4.3強(qiáng)酸耐受性試驗(yàn)選取產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，37 ℃下培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取沉淀，將沉淀重懸于pH值為2.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150r/min恒溫培養(yǎng)3h，分別在0、3 h取樣，以稀釋涂布平板法測(cè)定菌株濃度[14]。

1.4.4膽鹽耐受性試驗(yàn)將耐酸菌株接種于含0.3%豬膽鹽的MRS中，37 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)，于0、4、8 h各取樣1次，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度D值[15-16]。

1.4.5人工胃腸液耐受性試驗(yàn)將磷酸鹽緩沖液（PBS）滅菌后，調(diào)至pH值為2.5，加入0.3%過(guò)濾除菌后的胃蛋白酶，制成模擬人工胃液;將PBS滅菌后，調(diào)至pH值為6.8，加入0.1%的胰蛋白酶和0.3%的豬膽鹽，制成模擬人工腸液[16]。

將活化3代的菌液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用上述模擬人工胃液將菌體重新震蕩懸浮，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)3 h。然后將處理后的乳酸菌按照2%接種量接入至人工腸液中，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)，分別于0、4、8 h取樣，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度D值。

1.4.6抑菌試驗(yàn)將耐酸、耐膽汁的供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，離心取上清液，并用0.2 μm的過(guò)濾膜除菌，制得供試菌株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液。

采用牛津杯法測(cè)定供試菌株的抑菌效果，利用牛津杯雙層平板法將5株指示菌株分別混合于上層MRS軟瓊脂培養(yǎng)基中。待凝固后，采用鑷子將無(wú)菌牛津杯置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，吸取供試菌株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL于牛津杯中，先于4 ℃下放置4～5 h，使培養(yǎng)液完全擴(kuò)散，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑[17]，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取其平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。采用Microsoft Excel 2007及IBM SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2乳酸菌菌株的鑒定

2.1乳酸菌基因組總DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取乳酸菌的基因組總DNA。

2.2乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序與同源性分析

以乳酸菌菌株基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3′），對(duì)乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;然后 94 ℃ 變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物大小經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證后，將目標(biāo)條帶進(jìn)行純化，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物的Sanger測(cè)序[18-19]。

將乳酸菌序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Informmion，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用BLAST在線服務(wù)器（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將其與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)比對(duì)得分最高的已知乳酸菌種類確定種名。

3結(jié)果與分析

3.1分離菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力比較

通過(guò)含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基對(duì)雞腸道中的乳酸菌進(jìn)行篩選，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑選生長(zhǎng)旺盛、溶鈣圈明顯的菌落。將上述菌落繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行平板劃線分離，得到純化后具有溶鈣圈的革蘭氏陽(yáng)性菌疑似乳酸菌9株，對(duì)9株疑似乳酸菌菌株編號(hào)為L(zhǎng)1～L9（表1）。

3.2強(qiáng)酸耐受性比較

選取產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌株，進(jìn)行強(qiáng)酸耐受性試驗(yàn)，得到4株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，于pH值為2.5的強(qiáng)酸MRS培養(yǎng)基中37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 h，使用稀釋涂布平板法檢測(cè)活菌數(shù)，見(jiàn)表2。

由表2可知，4株產(chǎn)酸能力比較強(qiáng)的菌株對(duì)酸的耐受能力不同，其中L2、L4對(duì)酸的耐受能力達(dá)到100%，L3耐受力為24.5%，L6耐受力為19%。選擇L2、L4進(jìn)行下步試驗(yàn)。

3.3膽鹽耐受性比較

將產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的2株乳酸菌L2、L4取 200 μL 接種于5 mL含有0.3%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)8 h，吸光度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，2株乳酸菌受0.3%膽鹽脅迫，仍能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，L2的膽鹽耐受能力顯著低于L4的耐受力。

3.4乳酸菌抑菌試驗(yàn)

通過(guò)牛津杯平板法對(duì)2株乳酸菌進(jìn)行抑菌能力檢測(cè)，由表4可知，2株菌株對(duì)5株指示菌株的抑菌圈平均直徑均在18 mm以上，說(shuō)明2株乳酸菌對(duì)以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌、以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌都具有非常明顯的抑菌效果。

乳酸菌對(duì)致病菌的最低抑菌濃度可以在一定程度上反映金黃色葡萄球菌對(duì)乳酸菌的敏感性，也反映了乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。抑制濃度越低，乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用越明顯。由圖1、圖2可知，雖然接種5%乳酸菌無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，但效果不明顯。而接種10%以上的乳酸菌無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用幾乎達(dá)到100%。結(jié)果表明，一定量的乳酸菌無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。所得數(shù)據(jù)可為未來(lái)工業(yè)應(yīng)用中添加乳酸菌質(zhì)量濃度的選擇提供直接參考。

3.5耐人工腸胃液比較

由表5可知，2株乳酸菌經(jīng)人工胃液處理3 h后，活菌數(shù)無(wú)明顯差異。將2株經(jīng)人工胃液處理后的乳酸菌轉(zhuǎn)接至人工腸液中，發(fā)現(xiàn)2株乳酸菌均不受人工腸液影響，能夠正常生長(zhǎng)，由此推斷2株乳酸菌不但能夠耐受人工胃液，而且能夠在腸液中生長(zhǎng)，具備良好的腸胃液耐受能力。

4菌種鑒定

結(jié)果表明，菌株L2 16S rDNA基因序列與植物乳桿菌（L. plantarum）均有高于99%的同源性，確定L2菌株為植物乳桿菌。L416SrDNA基因序列

5結(jié)論與討論

乳桿菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中，如發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉類等。本研究從雞十二指腸黏膜上分離得到的2株乳桿菌，較分離于自然環(huán)境下的乳桿菌更易于定殖在動(dòng)物腸道內(nèi)，維持腸道菌群平衡，經(jīng)16S rDNA鑒定屬于植物乳桿菌和短乳桿菌。本研究中的2株乳桿菌，產(chǎn)酸、耐酸性能較為突出，均能在pH值=2.5的培養(yǎng)基中生存，這說(shuō)明2株乳桿菌能夠通過(guò)胃達(dá)到腸道，這為其發(fā)揮益生性能起到了先決作用。2株乳酸菌在含0.3%膽堿培養(yǎng)基中能夠生存并繁殖，滿足了優(yōu)良益生菌的特性。此外，2株乳桿菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌都具有良好的抑菌效果。由此可知，2株乳酸菌對(duì)動(dòng)物腸道及食品中的有害細(xì)菌具有廣譜抑菌作用，這對(duì)發(fā)酵肉制品、蔬菜等食品生產(chǎn)和貯存具有重要意義。

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