不同來源血清對體外培養(yǎng)驢巨噬細胞的影響

梁鞏 張強 郭旭川 陳慧颯 王艷萍 曾維斌

摘要：為比較驢血清和胎牛血清對體外培養(yǎng)驢巨噬細胞的影響，采用含10%驢血清或胎牛血清的培養(yǎng)液進行驢巨噬細胞培養(yǎng)的對比試驗，分別在培養(yǎng)的1、4、7、10 d時觀察細胞的生長狀況，并用MTT法通過細胞吸光度檢測細胞活力;培養(yǎng)后4 d采用流式細胞儀檢測巨噬細胞的純度。結果表明，含10%驢血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的驢巨噬細胞的分化能力優(yōu)于胎牛血清;培養(yǎng)后1、4 d時，2種血清對巨噬細胞活力的影響沒有顯著差異，但培養(yǎng)后7、10 d，驢血清組的細胞活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組;培養(yǎng)后4 d，2組試驗中巨噬細胞的純度分別為（92.72±0.45）%和（81.16±2.13）%。綜上，驢血清組培養(yǎng)的巨噬細胞其分化能力、活力和純度均優(yōu)于胎牛血清組，故更適合用于驢巨噬細胞的體外培養(yǎng)。

關鍵詞：驢;MTT法;同源血清;異源血清;巨噬細胞;分化能力;活力;純度;體外培養(yǎng)

中圖分類號：S822.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0072-04

收稿日期：2019-07-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：31760643）;石河子大學高層次人才科研啟動項目（編號：RCZX201501）;新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題（編號：HS201504）。

作者簡介：梁鞏（1993—），男，新疆且末人，碩士研究生，研究方向為動物繁殖與生物技術。E-mail：2731327322@qq.com。

通信作者：曾維斌，副教授，研究方向為動物繁殖與生物技術。E-mail：zwbdky@126.com。血清支持細胞生長及繁殖的能力是在細胞培養(yǎng)過程中評價血清質量的重要指標之一，血清的選擇對于細胞的培養(yǎng)有非常重要的意義[1]。血清中由于含有多種促細胞生長的營養(yǎng)成分及細胞因子，因此成為體外細胞培養(yǎng)液中的常用添加成分，其對細胞的培養(yǎng)意義重大。細胞培養(yǎng)液中，常用的血清主要來源于牛、豬、雞等，其中胎牛血清因其獲得量大、污染相對較小而得到廣泛地應用，但不同來源的血清對不同的細胞培養(yǎng)效果各有差異[2-3]，來自同種動物的同源血清體外培養(yǎng)的細胞，其分化能力與貼壁能力均顯著優(yōu)于異源血清培養(yǎng)的細胞，另外同源血清的應用可減少向培養(yǎng)液中添加較為昂貴的細胞生長因子[4-6]。

巨噬細胞作為重要的免疫細胞，是機體免疫反應的第1道防線[7-8]。它也參與穩(wěn)態(tài)調節(jié)，包括纖維化、脂質代謝和組織重塑[9]，巨噬細胞的分離與培養(yǎng)可為免疫學研究提供基礎的細胞材料。目前，有大量試驗對牛、鼠、猴等巨噬細胞進行研究[1，4，6]，但有關驢巨噬細胞的分離及培養(yǎng)尚未見報道，因此本研究以驢外周血來源的巨噬細胞為試驗對象，比較含10%驢同源血清與10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液對體外驢巨噬細胞培養(yǎng)的影響，以便建立一種體外培養(yǎng)驢外周血單核巨噬細胞的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑淋巴細胞分離液、MTT試劑盒、青霉素鏈霉素混合溶液，均購自于Solarbio公司;DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液，均購自于Gibco公司;M、CD14抗體（美國BD公司）。

1.1.2試驗動物新疆石河子大學試驗站驢場體質量一致、體況較好的新疆母驢。

1.2方法

1.2.1驢血清的制備選擇健康母驢3頭，采用真空無抗凝劑采血管于頸靜脈采集全血，室溫靜置 30 min，3 000 r/min離心10 min，取淡黃色上清液，采用0.22 μm濾菌器過濾除菌，56 ℃水浴15 min，最后冷凍保存于-20 ℃下。

1.2.2外周血單核細胞（PBMCs）的分離、培養(yǎng)將采集的全血用磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）等倍稀釋混勻后，緩慢加到淋巴細胞分離液上層（兩者的體積比為1 ∶1），1 800 r/min 離心30 min，采用移液器吸取血漿稀釋液與淋巴細胞液中間的PBMCs層，將獲得的PBMCs用PBS緩沖液等倍稀釋混勻，1 000 r/min離心10 min，去除上清液，將沉淀的PBMCs再用PBS緩沖液洗1次，最后采用DMEM培養(yǎng)液清洗1次后將沉淀的PBMCs用培養(yǎng)液混勻，細胞計數(shù)器計算細胞的濃度，將PBMCs置于含10%驢同源血清或胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，約為1×105個/孔，4 h后吸棄細胞液，除去未貼壁細胞，在加入含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并定時觀察細胞形態(tài)。每隔2 d更換相對應的培養(yǎng)液。

1.2.3MTT法檢測細胞的活力在巨噬細胞培養(yǎng)后1、4、7、10 d，吸棄細胞培養(yǎng)液，加90 μL新鮮含血清DMEM培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，然后吸棄上清，加入110 μL甲臜（formazan）溶解液，置于搖床低速振蕩10 min，然后采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的吸光度（D490 nm）。

1.2.4巨噬細胞純度的檢測在細胞培養(yǎng)后4 d，吸除細胞培養(yǎng)液，用PBS緩緩沖洗2遍貼壁細胞;然后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，在倒置顯微鏡下觀察細胞絕大部分懸浮收縮變圓后，分別加入對應的培養(yǎng)液終止消化;離心收集所有細胞，加 400 μL PBS緩沖液混勻，再加入CD14抗體15 μL（空白組未加），在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，1 000 r/min 離心5 min棄液，再用PBS混勻、離心洗滌2次;最后每管加入PBS 400 μL重懸細胞后，采用流式細胞儀檢測細胞的純度（CD14表達陽性率）。

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有試驗至少重復3次，結果采用“平均值±標準差”表示，P<0.05或P<0.01分別表示數(shù)據(jù)間差異顯著或極顯著。

2結果與分析

2.1不同血清對細胞生長形態(tài)的影響

由圖1可知，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1 d時2組細胞形態(tài)均為顆粒狀且數(shù)量很多。在細胞培養(yǎng)后4 d，胞體明顯增大，細胞已經出現(xiàn)分化，胞體由顆粒狀向長梭狀或不規(guī)則形狀生長，眼觀2組間無太大差異。然而在培養(yǎng)后7 d，2組均可見偽足出現(xiàn)（箭頭所指方向），且驢血清組的分化能力優(yōu)于胎牛血清組，另外2組細胞數(shù)量相比于培養(yǎng)后1 d明顯減少。在細胞培養(yǎng)后10 d，驢血清組的分化更加成熟，但胎牛血清組中的細胞無論是分化能力還是數(shù)量均在下降。

2.2不同血清對細胞活力的影響

由圖2可知，經MTT法檢測，隨著培養(yǎng)時間延長，2組的細胞活力均在逐漸降低。培養(yǎng)后4 d的2組細胞活力均顯著低于培養(yǎng)后1 d的細胞活力（P<0.05），且胎牛血清組在培養(yǎng)后1、4、7、10 d的細胞活力均有顯著差異（P<0.05）。

培養(yǎng)后1、4 d，2組的巨噬細胞活力沒有顯著差異，但在培養(yǎng)后7、10 d，驢血清組的細胞活力均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組。

2.3驢巨噬細胞純度的檢測

由圖3可知，采用含10%驢同源血清、胎牛血清培養(yǎng)的驢巨噬細胞4 d CD14表達陽性率分別為（92.72±0.45）%、（81.16±2.13）%，驢同源血清培養(yǎng)的驢巨噬細胞 CD14表達陽性率顯著高于胎牛血清培養(yǎng)的驢巨噬細胞。

3討論與結論

巨噬細胞在炎癥反應和宿主防御中發(fā)揮核心作用，促進先天免疫的建立，所以它得到了廣泛研究[7-9]。分離培養(yǎng)單核巨噬細胞的方法多種多樣，如從骨髓、腹腔、外周血中均可成功地分離培養(yǎng)巨噬細胞[10-12]。從外周血中分離出來的單核細胞具有很強的貼壁能力，而且容易在體外誘導分化為單核巨噬細胞。這種通過外周血單核細胞分化的巨噬細胞已被廣泛用于科學研究工作中，是一種普遍被科研工作者接受的原代巨噬細胞模型。楊菲菲

利用不同仔豬血清濃度體外培養(yǎng)金華豬細胞表明，在10%仔豬血清濃度培養(yǎng)的細胞其傳代活力強、增殖迅速，含10%血清濃度的培養(yǎng)液更適合原代細胞的培養(yǎng)[13]，因此本試驗采用含10%血清濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。體外培養(yǎng)恒河猴外周血單核巨噬細胞時發(fā)現(xiàn)，猴同源血清優(yōu)于胎牛血清[6]，貼壁細胞分化能力更強，胞體由顆粒狀向長梭狀或不規(guī)則形狀生長，胞體由顆粒狀逐漸伸出偽足，說明該方法培養(yǎng)的巨噬細胞已經具備了巨噬細胞的基本特征[14]。以上結論與本試驗相一致，表明同源血清比異源血清更能誘導細胞的分化能力。可能由于血清內含有各種刺激或抑制細胞生長因子，在一定程度上起著保持或改變細胞生物學特性的作用[15]。

細胞相對衰減是衡量血清相對促細胞生長作用的一種評價方法[16]。在研究其他外周血單核巨噬細胞體外培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)的前幾天是細胞的適應期，細胞數(shù)量變化比較大。一方面，細胞從體外分離過程中受到損傷并且要適應新的環(huán)境，所以有大量的細胞死亡。另一方面，在換液的過程中淋巴細胞被洗棄了。因此，采用MTT法檢測細胞活力時發(fā)現(xiàn)細胞活力逐漸下降，并且剛開始下降速度差異比較大[16-18]。沈前程等采用MTT法檢測培養(yǎng)貼壁單核巨噬細胞的相對活力，結果顯示，貼壁細胞體外培養(yǎng)72～120 h時，細胞數(shù)量相對穩(wěn)定，組間差異不顯著（P>0.05）[18]。本研究也采用MTT法檢測驢巨噬細胞活力，結果表明，細胞在培養(yǎng)后4、7 d，兩者差異不顯著，因此可在細胞培養(yǎng)后4～7 d這一相對平穩(wěn)期開展后續(xù)的試驗研究。

林煒明等在用10%人血清及人M-CSF培養(yǎng)人外周血巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，通過免疫磁珠分選后得到CD14的陽性率為85.5%[19]。盡管這些方法也能分離出巨噬細胞，但分離出來的成本更高，因此本試驗采用同源血清進行培養(yǎng)，省去無需添加生長因子和免疫磁珠分選等步驟，采用流式細胞儀檢測的單核巨噬細胞純度為（92.72±0.45）%。猴巨噬細胞在培養(yǎng)后4、7 d的CD14細胞的陽性率分別為（91.7±2.33）%、（96.4±1.93）%[6]，本研究結果與之相似，表明同源血清培養(yǎng)巨噬細胞是一種可行的方法。

綜上所述，驢血清組培養(yǎng)的巨噬細胞的分化能力、活力和純度均優(yōu)于胎牛血清組，故更適合于驢巨噬細胞的體外培養(yǎng)，而究竟同源血清中哪幾種成分起了重要的作用，還須作進一步相關試驗研究。

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