內生木霉菌與石斛相互作用關系的研究進展黃位年

曾華蘭 華麗霞 葉鵬盛 何煉 蔣秋平 張敏

摘要：石斛是典型的菌根植物，木霉菌是一種重要的內生菌和生防菌，深入開展兩者之間相互作用關系的研究對石斛的人工栽培和石斛內生木霉菌的應用具有重要意義。綜述內生木霉菌與石斛相互作用關系的研究進展，包括木霉菌在石斛上的定殖，木霉菌對石斛的促生作用、抗病作用及其在石斛人工栽培中的應用等;最后展望下一步的研究方向，對石斛內生木霉菌進行系統研究、開發(fā)利用和共生機制等方面的研究提出建議。

關鍵詞：木霉;石斛;共生;促生作用;抗病作用;研究進展

中圖分類號： Q143+.2;S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0057-05

收稿日期：2019-08-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：31701830）。

作者簡介：黃位年（1987―），男，廣西蒙山人，主要從事中藥材品種選育及栽培技術研究。E-mail：626564014@qq.com。

通信作者：葉鵬盛，碩士，研究員，主要從事經濟作物育種與栽培。E-mail：yps18@163.com。木霉（Trichoderma spp.）屬真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科，喜長于木屑、樹皮等富含腐蝕質的基質上，是一類適應性強、繁殖速度快、具有較高生防價值的真菌，對多種植物病害有防治作用。部分木霉菌能夠定殖于石斛組織上，哈茨木霉、深綠木霉、綠木霉等木霉菌能與植物產生共生關系[1-2]。石斛屬（Dendrobium spp.）是蘭科附生植物中較大的屬，目前在全世界共發(fā)現約1 000種，我國有74種和2個變種，常見的有鐵皮石斛、齒瓣石斛、細莖石斛、束花石斛、霍山石斛等，其中鐵皮石斛和金釵石斛均被我國歷版藥典所收錄，具有生津滋陰等功效，是重要的中藥材資源[3-4]。石斛為附生植物，肉質根，野生多見生長于樹皮、樹干上或石縫中，是典型的菌根植物，具有豐富的內生真菌。木霉菌是石斛25種內生真菌之一[5]，在石斛生長和病害防控過程中起到重要的作用。隨著石斛組培和人工繁殖技術的成熟和推廣，種植面積不斷擴大，在云南、廣西、四川、浙江等省份均有人工栽培，2017年鐵皮石斛在全國的種植面積已經超過 6 667 hm2，年產量1萬t以上，產業(yè)規(guī)模已突破百億元[6]。為了提高石斛的產量和效益，部分人工栽培中存在濫用多菌靈、甲基托布津等殺菌農藥的現象，不但增加農殘超標的風險，影響到石斛的品質，還會破壞石斛根際有益微生物菌群。石斛和木霉都喜好生長于透氣的有機質中，利用內生木霉菌與石斛之間的相互作用關系，提高人工種植石斛的產量和品質，是推動石斛產業(yè)綠色健康發(fā)展行之有效的方法。本文綜述總結近幾年來石斛內生木霉菌與寄主相互作用的研究和應用進展，并就石斛內生木霉的研究與應用進行展望，旨在為今后石斛內生木霉菌的研究及其在農業(yè)生產中的應用提供參考。

1石斛內生木霉菌的分離與鑒定

1.1石斛內生木霉菌的分離

石斛內生菌的獲得主要采用組織分離法，經過表面消毒后，將石斛的根、莖、葉或菌絲團等組織接種到真菌分離培養(yǎng)基上分離純化。單獨分離石斛內生木霉菌的研究較少，多見于石斛內生真菌多樣性分析，能夠分離到石斛內生菌的培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）[7]、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）（含鏈霉素）[8]、真菌分離培養(yǎng)基（FIM）[9]等，但只能分離到少量的內生木霉菌。柴曉蕾等使用PDA、1/5 PDA、FIM、華石斛粉培養(yǎng)基（水瓊脂和加華石斛粉）等4種不同的培養(yǎng)基分離內生真菌，結果只在華石斛粉培養(yǎng)基中分離得到1株木霉菌[10]。

分離時，由于受到其他生長較快的真菌的抑制，分離培養(yǎng)基對石斛內生木霉菌的分離影響較大，不同培養(yǎng)基種類分離內生木霉菌的能力存在差異，通用真菌分離純化培養(yǎng)基分離內生木霉菌的效率較低，為了提高木霉菌的分離效率可使用木霉選擇培養(yǎng)基，如秸稈培養(yǎng)基、麥糠培養(yǎng)基或木霉專用培養(yǎng)基等。利用不同細菌、放線菌和木霉菌對抗菌物質的敏感程度的差異，在分離培養(yǎng)基中加入丙酸鈉、慶大霉素[11]、氯霉素、孟加拉紅、敵克松、克菌丹[12-13]等選擇木霉真菌的成分，可抑制多數根霉菌、毛霉菌、細菌、放線菌，提高木霉的分離成功率。Elad等研制出的木霉屬真菌專用培養(yǎng)基TSM及其改進型培養(yǎng)基（TME），可抑制毛霉、根霉、鐮刀菌等快速生長的真菌[12-13]，其他木霉專用選擇培養(yǎng)基還有TSB[14]、PDAm[15]等。木霉屬真菌是一個龐大的家族，在木霉真菌分離過程中，選擇合適的培養(yǎng)基分離內生木霉菌至關重要，須在了解樣品中微生物種類的基礎上選擇恰當的抗菌物質，避免錯用抗菌物質從而對木霉屬真菌的分離產生較大影響，因此，建議不只使用1種分離培養(yǎng)基[16]。夏曉敏從5種分離培養(yǎng)基中篩選出TSB和改良的TSM培養(yǎng)基，能專一性地分離出大量的香蕉根系木霉菌，共分離得到7種187株木霉菌，其中29株為內生木霉，表生木霉5種，內生4種，其中棘孢木霉和綠色木霉是內表均可生長，短密木霉、黃綠木霉僅在根內分離得到，為香蕉內生木霉菌的多樣性分析奠定了基礎[17]。

1.2石斛內生木霉菌的鑒定

形態(tài)學是內生真菌鑒定的重要方法，依據真菌菌絲、產孢結構、孢子形態(tài)及發(fā)育特點等，盧東升等在野生鐵皮石斛根內分離鑒定出長孢木霉和深綠木霉[7]。但對于形態(tài)性狀復雜、易受環(huán)境影響、特征不顯著的內生真菌不易鑒定，利用分子生物學方法在一定程度上能有效地解決這一難題[18]。因此，采用形態(tài)學進行初步鑒定后，再用分子生物學的技術進行鑒定，可以提高石斛內生木霉菌的鑒定率和鑒定準確性。用于木霉菌鑒定或多樣性分析的分子生物技術有核糖體內轉錄間隔區(qū)序列分析（rDNA-ITS）、通用引物PCR（UP-PCR）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴增片段多態(tài)性（AFLP）等。其中rDNA-ITS技術多態(tài)性水平高、可靠性好、技術難度和成本低[19]。該技術利用內轉錄間隔區(qū)（ITS），如ITS1、5.8S和ITS2，既具保守性，又在科、屬、種水平上具有特異序列的特性，應用ITS序列中不同位置上的幾段特異的寡核苷酸序列，與數據庫中的條形碼進行比對，從而鑒定出真菌的屬或種。目前，使用rDNA-ITS技術在尖刀唇石斛、鉤狀石斛[8]、流蘇石斛[20]等石斛的體內均分離鑒定得到了內生木霉菌，提高了分離內生菌的鑒定率。

2木霉菌在石斛上共生的影響因素

2.1環(huán)境對木霉菌-石斛共生的影響

木霉菌在石斛上的定殖能力受生境、石斛種類等多種因素影響，不同地域環(huán)境條件下石斛內生木霉菌的種類和數量存在顯著差異[20]，這是適應生存環(huán)境選擇的結果。生境集合了光、溫度、濕度、基質等非生物因子，也包括根際微生物種群等生物因子，是影響木霉菌在石斛上定殖的主要因素。在部分生境下，木霉菌是蘭科菌根內的優(yōu)勢屬[21]，而在部分生境下分離不到內生木霉菌。水分適中、溫度溫和、pH值偏酸的環(huán)境有利于木霉菌株的定殖[22]。王淑媛等研究不同種質、生境和附生立木對鐵皮石斛內生真菌種類多樣性及分布狀況的影響，發(fā)現不同地理環(huán)境鐵皮石斛內生真菌的優(yōu)勢類群分布存在較大差異，木霉菌僅為浙江省義烏市上溪鎮(zhèn)的優(yōu)勢屬，而在浙江省臨安市的鐵皮石斛上并未分離到;不同種質和附生立木對鐵皮石斛內生真菌多樣性與豐富度無顯著影響[23]。毛益婷等對比了2種不同生境野生鐵皮石斛的內生真菌，在內生真菌多樣性高的廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)內未分離到內生木霉菌，而在偏干旱環(huán)境的崀山鐵皮石斛內分離得到了內生木霉菌[24]。

2.2石斛種類對木霉菌-石斛共生的影響

即使在相同生境下，木霉菌對不同種類石斛的定殖能力存在差異，具有一定的宿主特異性，可能與兩者之間的相互識別有關。目前在野生石斛和人工栽培石斛上均有分離得到內生木霉菌，如華石斛[9]、流蘇石斛[20]、鉤狀石斛[8]、鐵皮石斛[25]等。洪群艷等鑒定分析云南省德宏州的8種野生石斛內生真菌，結果只在長蘇石斛莖上分離得到木霉菌[26]。毛益婷在崀山生境下的鐵皮石斛和羅河石斛內分離到了木霉菌，而在重唇石斛內未分離到;在舜皇山生境下，在霍山石斛、羅河石斛中分離到了木霉屬，而在細莖石斛內并未分離到[27]。

2.3石斛內生木霉菌定殖的組織特異性

木霉菌在石斛上的定殖受不同組織類型間的組織結構、營養(yǎng)成分和其他內生微生物等微觀環(huán)境影響，主要定殖在石斛的根[26]、莖[10]內，葉、原球莖等組織內鮮見報道，具有一定的組織特異性。木霉菌能趨向性地在根毛基部、根外皮層通道細胞、莖表和葉面腺毛基部等分泌物較多的位點侵入組織內部，并在一定范圍內傳導，在不同植物組織間定殖能力存在顯著差異[22]。柴曉蕾等在華石斛的根、莖、葉中分離內生真菌，結果只在莖內分離得到5株木霉菌，占莖內真菌分離總數的11.11%，為第二大優(yōu)勢菌群[10]。王淑媛等分析浙江省義烏市上溪鐵石斛栽培基地松樹木段上種植的鐵皮石斛根、莖和葉內生真菌的分布情況，發(fā)現不同組織優(yōu)勢菌種存在差異，木霉菌主要分布在鐵皮石斛根內[23]。

3內生石斛木霉菌對宿主生長的影響

內生菌對石斛種子的自然萌發(fā)和植株生長具有促進作用，在石斛生活史中扮演重要角色[28-29]。范黎等發(fā)現分離自狹葉紫毛兜蘭的木霉菌菌株OEF0064能與報春石斛和長蘇石斛種子形成共生關系，為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)[30]。從石斛的組織中分離出了長孢木霉、深綠木霉[7]、綠孢木霉[31]等具有內生特性的菌株，能與石斛形成互利共生的關系，一方面內生木霉菌的代謝物能刺激石斛的生長發(fā)育，提高宿主對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力，甚至直接為石斛提供營養(yǎng);另一方面石斛為木霉菌提供光合作用產物和礦物質。

一部分根際真菌能通過外皮層通道細胞或破壞根部組織和外皮層細胞，侵入皮層細胞，與宿主形成共生關系。在皮層細胞內新定殖的和正在被消化侵入的菌絲或菌絲結維持著動態(tài)平衡，隨著菌絲及菌絲團被逐漸消解吸收[32]，不斷為植株提供維生素、氨基酸、植物激素等營養(yǎng)[33-34]，促進植株快速生長。另外，生長于根際的菌絲體通過釋放纖維素酶、木質素酶、還原酶、有機酸、螯合劑等方式，增加植物對氮（N）、磷（P）、鉀（K）及難容礦物質的吸收，提高養(yǎng)分利用率，改善根際微環(huán)境，促進植物生長[35-36]。部分木霉菌在石斛的根表和根內均有分布[7]，通過菌絲體將基質中的營養(yǎng)輸送到石斛根內，大大增加了石斛根部營養(yǎng)吸收的面積，同時也提高了宿主的抗逆能力和適應能力。徐文婷等選用石斛的內生真菌制備菌劑，研究其對鐵皮石斛的定殖和促生效果，在田間試驗中，木霉菌制劑能顯著提高鐵皮石斛幼苗的存活率，有效提高幼苗的株高和根系生長，顯著提高鮮質量和干質量及葉綠素a、葉綠素b含量，植株N、P、K的含量顯著高于對照，說明該內生木霉菌劑對石斛具有良好的促生效果[37]。剛擴繁出的蘭科組培苗適應外界能力差，篩選出合適的內生木霉菌能夠提高組培苗適應環(huán)境的能力，提高成活率。黃磊等從墨蘭中分離得到4株木霉菌菌株，分別施用到種植有春蘭與大花蕙蘭雜交種子培育出的組培苗基質上，發(fā)現zjm002對瓶外組培苗的生長有促進作用，8個月的成活率可達100%，比對照質量增加16.95%[38]。

4內生石斛木霉菌對宿主的抗病作用

石斛內生菌資源豐富，蘊含著大量的抗病、抑菌菌株[8，39]，木霉菌是其中重要的成員。木霉菌可以通過以下方式提高植物的抗病力：與其他菌根微生物競爭、搶占根部的有利生態(tài)位點，在穿入區(qū)周圍形成胞壁沉積物，增加植物細胞壁的機械強度，減少病原菌侵入;分泌幾丁質酶、果糖酶等溶解病原菌細胞壁;提高植株生理生化指標以及防衛(wèi)基因的表達水平[40]，同時改變根際微生物種群，增加放線菌、固氮菌等有益根際微生物的數量，有效減少病原菌的侵害，對石斛的病害防治具有重要作用。

石斛常見的病害有白絹病、莖腐病、黑斑病、灰霉病等，引起這些病的病原菌分別為齊整小核菌、鐮孢菌、極細鏈格孢菌、灰葡萄孢菌等[41]，有研究表明木霉對這些病原菌具有拮抗作用，甚至產生抑制作用[42-43]。朱江敏等利用分離自野生石斛的木霉菌菌株F35對病原真菌鐮刀菌進行對峙培養(yǎng)，拮抗系數為Ⅱ級，經測定發(fā)現該菌種能分泌高活性的幾丁質酶，分解病原菌的細胞壁，這可能是其實現拮抗作用的原因[44]。邢詠梅等利用分離自齒瓣石斛的內生木霉菌擬康寧木霉（T.koningiopsis）進行金釵石斛盆栽試驗，發(fā)現其對終極腐霉菌具有較強的拮抗活性，在雙培養(yǎng)平皿對峙試驗中對終極腐霉菌表現出了抑制作用;其分泌的 β-1，3葡聚糖酶和β-1，4葡聚糖酶活性都較高，可能是其在破壞終極腐霉菌細胞壁方面發(fā)揮了作用;同時該菌種對金黃色葡萄球菌等具有明顯的拮抗作用[45]。在其他作物上的研究表明，木霉菌與叢枝菌根真菌（AMF）、枯草芽孢桿菌[46]等益生菌合用能夠減少作物的連作障礙、改善作物根際菌群，促生和控病作用更顯著。哈茨木霉與叢枝菌根真菌合用能有效減低丹參連作病害的發(fā)生率，病害發(fā)生率比對照組降低了61.50%，并且提高了丹參根中丹酚酸 B和隱丹參酮的含量[47]。

5內生木霉菌在石斛等蘭科植物生產上的應用

木霉菌生長快，對氮源和碳源具有較高的利用率，能夠快速在基質中繁殖，減少病害的發(fā)生，在生產上具有較高的生物防控價值。將石斛內生木霉菌應用于生產上，利用木霉菌與石斛產生共生關系，不但能增加石斛的產量，提高石斛多糖和總生物堿等成分的含量，同時可以對病害起到防治作用，避免其他有害微生物的侵染，具有廣闊的應用前景。徐文婷等對比不同的保存基質保存木霉菌和其他共生內生菌，對比得出使用草炭土保存效果最好，6個月后菌體數量達到8.1×107 CFU/g;在田間試驗中，接種菌劑的鐵皮石斛植株鮮質量和干質量顯著提高[37]。應奇才等研制出含有木霉菌F35菌株的石斛菌根菌復合菌劑，確定了其保存期及最適用量，金釵石斛組培苗移栽試驗結果表明，施用復合菌劑的金釵石斛組培苗干質量比對照提高29.03%，比單一菌劑提高8.11%～17.65%，石斛多糖和總生物堿含量顯著提高[48]。能夠大面積應用于石斛生產上的木霉菌制劑鮮有報道，在生物防治方面，使用木霉菌制劑防治其他蘭科植物的研究較多。李霞等對比木霉菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等3種不同生防菌對香莢蘭根腐病作用的研究結果表明，木霉菌對尖鐮孢菌香莢蘭?；偷囊种坡士蛇_78.57%，比枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌的抑制作用更強，建議在溫室、大田試驗時優(yōu)先考慮使用木霉菌和枯草芽孢桿菌[49]。魏林等使用哈茨木霉菌菌劑T2-16對建蘭防病及促生的研究結果表明，木霉菌制劑不同處理方式對白絹病、黑腐病和炭疽病等3種真菌性病害的防治效果優(yōu)于或相當于純白多菌靈處理，并且對建蘭具有促進長葉、發(fā)枝、延長花期的效果[50]。

6展望

石斛菌根中存在著包括木霉菌在內的許多有益促生和控病真菌，對石斛的生長發(fā)育、系統演化、病蟲害防御起著重要作用，是一座值得深入開發(fā)的“寶庫”。溫室栽培的蘭花內生真菌種類明顯少于野生蘭花，且種類不同[51]，開發(fā)和利用石斛內生木霉菌，可以促進石斛的生長，同時可以防治白絹病、黑腐病和炭疽病等病害，減少化肥農藥的施用，提高人工栽培石斛的品質和產量，對石斛種植產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。但目前的研究主要集中于石斛內生真菌的分離和多樣性分析，缺乏對石斛內生木霉菌的系統研究和產品開發(fā)，建議下一步從以下3個方面進行深入研究。

6.1對野生石斛內生木霉菌進行系統調查、分離、鑒定

使用木霉菌專用培養(yǎng)基對石斛內木霉菌進行分離，再利用分子生物學的方法對分離的木霉菌進行鑒定，建設資源保存庫進行收集和長期保存，為后續(xù)的開發(fā)利用研究奠定基礎。

6.2加強石斛內生木霉菌的開發(fā)和利用

瓶內共培養(yǎng)是石斛共生菌鑒定的常用方法，由于木霉菌利用碳氮的能力強，瓶內共培養(yǎng)時生長速度快，不利于與石斛共生關系的建立，因此建立木霉與石斛共生關系的評價方法，才能篩選出更多的木霉共生菌株。利用誘變育種、基因工程等技術手段對內生木霉菌進行改造，篩選出定殖能力強，又具有抗病促生作用的菌株。探索菌劑規(guī)?；a、保存、使用等技術，開展示范及推廣。

6.3深入分子和基因水平開展機制研究

深入分子和基因水平開展內生木霉菌與石斛促生、控病作用機制的研究，探索兩者形成共生關系的識別機制及建立的條件，明確內生木霉菌對石斛品質的影響等。

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