缺血性腦卒中患者抵抗阿司匹林干預(yù)與GP1BA基因多態(tài)性關(guān)系的探討

楊秀峰,劉 凈,喬 馨,趙 敏,楊冬梅

(大慶油田總醫(yī)院,黑龍江 大慶163000)

隨著人口老齡化腦卒中發(fā)生率逐年上升，腦卒中已成為我國目前導(dǎo)致人類死亡的第二位原因。缺血性卒中(IS)發(fā)病率占腦卒中60%-80%[1]，并具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率以及高死亡率等臨床特征。對于IS的抗血小板聚集治療，已經(jīng)被寫進多個國家的腦卒中防治指南。在心腦血管病一級和二級預(yù)防中已經(jīng)開始廣泛使用阿司匹林作為抗血小板藥物[2]，但5%-45%[3]的患者存在阿司匹林抵抗(AR)[4]。阿司匹林的主要作用是阻斷血栓素A2生成，而對于血小板活性沒有完全抑制效應(yīng)[5]。另外，由于長期應(yīng)用阿司匹林可以對部分個體帶來不良反應(yīng)，進一步降低了阿司匹林的臨床治療作用。為了進一步提高阿司匹林個體精準(zhǔn)治療效果，人們試圖尋找與阿司匹林治療相關(guān)的基因位點進行疾病治療效果預(yù)測，指導(dǎo)臨床治療。而血小板糖蛋白受體(GP1BA)與血小板功能有關(guān)，其編碼基因又具有功能多態(tài)性，因此，為了探討阿司匹林抵抗的分子生物學(xué)機制，以及為IS患者個體化抗血小板治療提供新思路，我們對126例IS患者的GP1BA基因多態(tài)性及治療后的血小板抑制率進行了檢測，探討其與IS患者阿司匹林抵抗的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月-2018年12月在黑龍江省大慶油田總醫(yī)院住院的缺血性腦卒中患者126例。所有患者均詳細記錄相關(guān)資料——性別、年齡、吸煙史、既往史(BMI)以及合并癥等。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②性別不限；③具有急性缺血性腦卒中體征，且經(jīng)顱腦CT或MRI影像學(xué)檢查證實，該診斷標(biāo)準(zhǔn)與《中國缺血性腦卒中診療指南2014》符合；④口服阿司匹林(100 mg/1次/天，拜耳公司100 mg/片)抗血小板治療作為腦卒中二級預(yù)防。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②心源性腦梗死；③出血性腦梗死；④接受免疫抑制劑或低分子肝素抗凝藥物治療的患者，服用影響血小板功能類藥物，阿司匹林過敏，出血傾向，血液疾病，消化性潰瘍病史；⑤急慢性感染性疾病以及嚴(yán)重心、肝、腎等多臟器功能障礙或衰竭；⑥惡性腫瘤、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。納入患者對本研究均知情同意，符合醫(yī)學(xué)倫理程序。

1.2 研究方法

1.2.1GP1BA基因多態(tài)性檢測 應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)，使用濟南廣音醫(yī)療科技有限公司實時熒光PCR儀，檢測入選患者GP1BA基因多態(tài)性。EDTA抗凝管采集靜脈血2 ml，2-8℃保存，72 h內(nèi)使用。檢測方法按照試劑盒說明書標(biāo)注的操作方法進行。根據(jù)檢測結(jié)果GP1BA存在3種基因亞型CC、CT、TT。據(jù)報道，在亞洲人群中CC、CT、TT基因型的頻率分別為71.8%、25.9%、2.30%[6]，CC基因型患者對阿司匹林的應(yīng)答相對較弱。CT和TT基因型患者對阿司匹林的應(yīng)答相對較強，故按照CC基因型以及CT+TT基因型將患者分為兩組。

1.2.2血小板抑制率測定 應(yīng)用血栓彈力圖(TEG)對兩組基因型患者于連續(xù)給藥7 d后晨起采集血樣標(biāo)本均予AA途徑測定其血小板抑制率。使用BD FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)，分別于枸櫞酸鈉抗凝管靜脈采血3 ml、肝素抗凝管靜脈血5 ml，于2 h內(nèi)測試。主要檢測血小板在凝血酶誘導(dǎo)激活形成的血凝塊強度(MAth)，缺少凝血酶對照組和血小板激活組的纖維蛋白網(wǎng)強度(MAfib)，以及血小板被激活劑激活的血凝塊強度(MAADP)，然后采用血小板抑制率公式進行計算抑制率：血小板抑制率=(MAADP-MAfib)/(MAth-MAfib)×100%。依據(jù)我院血栓彈力圖(血小板圖AA)試劑(凝固法)使用說明書制定評定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3觀察指標(biāo) 通過檢測二組患者(CC基因亞型組及CT+TT基因亞型組)的血小板抑制率，分析缺血性腦卒中患者阿司匹林抵抗與不同GP1BA基因亞型的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

本研究共納入126例患者其中男性78例，女性48例年齡范圍65-80歲。其中合并高血壓病73例(57.9%)，糖尿病38例(14.6%)，高血脂49例(38.9%)，吸煙65例(51.6%)。根據(jù)GP1BA基因型檢測結(jié)果CC基因亞型組78例(61.9%)，CT及TT基因亞型組48例(38.1%)。表1顯示兩組患者的一般臨床資料(性別、年齡、吸煙、BMI)以及合并疾病(高脂血癥、高血壓、糖尿病)，統(tǒng)計學(xué)分析兩組患者間各指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 GP1BA基因多態(tài)性與血小板抑制率

依據(jù)我院血栓彈力圖(血小板圖AA)試劑(凝固法)測定血小板抑制率結(jié)果，判定抗血小板聚集療效，同時提出臨床建議(表2)。對本研究所納入的126例患者治療后血小板抑制率與GP1BA基因多態(tài)性進行比較分析，結(jié)果顯示CC基因型組血小板抑制率低于CT+TT基因型組(表3)，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表2 血小板抑制率、藥效及臨床建議

表3 血小板抑制率與GP1BA基因多態(tài)性

3 討論

AIS是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病之一，也是一種需要長期管理的疾病，給患者家庭乃至整個社會帶來巨大的疾病與經(jīng)濟負擔(dān)。AIS復(fù)發(fā)率高致殘風(fēng)險大，因此預(yù)防卒中復(fù)發(fā)顯得極為重要。缺血性腦卒中的二級預(yù)防藥物以抗血小板藥物最為基礎(chǔ)，而且也是至今為止應(yīng)用最廣泛、研究也最多的一類藥物，臨床上應(yīng)用的抗血小板藥物有替格瑞洛、氯吡格雷以及阿司匹林等。其中阿司匹林的預(yù)防應(yīng)用最多，但在臨床實踐中阿司匹林抵抗(AR)為治療提出了挑戰(zhàn)。AR發(fā)生機制復(fù)雜，發(fā)生的確切原因還不明確。因此，考慮其形成原因可能是多因素綜合作用，其機制可能與阿司匹林使用劑量；患者對藥物的依從性；是否同時應(yīng)用非甾體消炎藥或質(zhì)子泵抑制劑等導(dǎo)致阿司匹林的遠期療效抵[7-9]，以及基因多態(tài)性、血小管旁路激活等多素因素具有相關(guān)性。基因多態(tài)性表現(xiàn)為藥物代謝酶轉(zhuǎn)運蛋白和作用靶點具有多態(tài)性，是藥物抵抗的一個重要因素。有研究表明，花生四烯酸相關(guān)代謝途徑(AA)可更易誘導(dǎo)血小板聚集故血小板聚集事件發(fā)生增加[10]。

GP1BA基因是阿司匹林的靶點基因之一。GP1BA基因編碼血小板表面膜糖蛋白(GPIb)，是由二硫鍵連接的α和β亞基組成的異二聚體。GpIb作為血管性血友病因子(VWF)的受體，其α和β亞基可與血小板糖蛋白Ⅸ、血小板糖蛋白V非共價結(jié)合形成完整的受體復(fù)合物。GPIb-IX-V，GPIb-IX-V復(fù)合物與VWF結(jié)合促進血管損傷后初始血小板與血管內(nèi)皮下膜的粘附，并且還啟動血小板內(nèi)信號傳導(dǎo)，增強血小板活化、止血或形成血栓。研究顯示，GP1BA(5792 C>T)T等位基因攜帶者可增加對阿司匹林的應(yīng)答[11]。本研究結(jié)果，126例患者CC基因亞型組78例(61.9%)，CT及TT基因亞型組48例(38.1%)。CC組血小板抑制率低于CT+TT組，提示GP1BA基因的多態(tài)性考慮與阿司匹林抵抗存在相關(guān)性。臨床可參考上述相關(guān)性，給予患者更加個體化、精確化抗血小板治療。

本研究的局限性在于納入研究樣本有限，還需同時充分考慮基因與基因、基因與臨床資料的差異等相互作用的影響，從而更好闡明抗血小板藥物抵抗的發(fā)病機制。希望隨著基因水平技術(shù)的飛速發(fā)展，通過對與AR相關(guān)基因多態(tài)性詳細和充分的分析，以制訂個體化最佳的藥物治療方案。