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    血清學試驗與FUT1基因測序鑒定類孟買血型OHmA

    2020-08-28 09:59:44郭淦平吳遠軍姬艷麗李見群吳樹杰溫妙珍
    中國實驗診斷學 2020年8期
    關鍵詞:孟買O型單克隆

    郭淦平,吳遠軍*,姬艷麗,李見群,吳樹杰,溫妙珍

    (1.東莞市婦幼保健院 輸血科,廣東 東莞523120;2.廣州血液中心臨床輸血研究所,廣東 廣州510095)

    類孟買血型是由于位于19q13.3的FUT1 基因突變,導致H抗原合成障礙,表現(xiàn)為紅細胞H抗原部分缺失的一種罕見血型。類孟買血型個體血漿中可存在抗-H,不相容輸血可能引起溶血性輸血不良反應,因此準確鑒定類孟買血型具有重要的臨床意義。我們對常規(guī)ABO血型鑒定中遇到的1例ABO血型正反定型不相符的就診者,通過血清學試驗和PCR-SSP 法FUT1基因測序證實其為類孟買血型OHmA,報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    就診者,女,24歲,停經(jīng)1個半月,自測絨毛膜促性腺激素(HCG)陽性,就診要求終止妊娠。B超提示宮內(nèi)早孕。在常規(guī)ABO血型鑒定時發(fā)現(xiàn)正反定型不符,而進行ABO、H和Lewis血型鑒定相關的血清學試驗,并進行PCR-SSP 法FUT1基因測序。

    1.2 儀器與試劑

    血型血清學專用離心機(KUBOTA,KA2200),單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-Lea、抗-Leb和A、B、O型標準紅細胞(均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)),單克隆抗-AB,抗-H(LORNE 實驗室有限公司生產(chǎn))。

    1.3 方法

    1.3.1用單克隆抗體試劑和標準紅細胞檢測紅細胞血型抗原和抗體 取試管12支,分別標識為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H(對照)”、“抗-Lea”、“抗-Leb”、“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”;在標識為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H對照”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的8支試管中分別加入相應單克隆抗體試劑100 μl,在標識為“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”的4支試管中分別加入受檢者血漿100 μl;再在標識為“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的7支試管中各加入濃度為3%-5%的受檢者紅細胞懸液50 μl,在標識為“抗-H對照”的試管中加入濃度為3%-5%的O型標準紅細胞懸液50 μl,在標識為“Ac”、“Bc”、“Oc”的3支試管中分別加入濃度為3%-5%的A、B、O型標準紅細胞懸液50 μl,在標識為“自身c”的試管中加入濃度為3%-5%受檢者紅細胞懸液50 μl。將12支試管內(nèi)反應物混勻后,用血型血清學專用離心機120 g離心1 min,肉眼和顯微鏡下觀察凝集情況。

    1.3.2吸收放散試驗檢測紅細胞弱表達的ABO血型抗原 取5人份B型血漿(各1 ml)混合后吸取2 ml,與受檢者壓積紅細胞1 ml混合,置于4℃吸收4 h(每30 min混勻一次),離心分離上清液,將壓積紅細胞用4℃生理鹽水連續(xù)洗滌4次,留取最后一次洗滌液與A型標準紅細胞反應以判定洗滌效果。在洗滌后的壓積紅細胞中加等容量生理鹽水,置56℃放散10 min,56℃保溫離心后吸取上清液(放散液)。取試管4支,分別標識為“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”、“洗+Ac”,在標識為“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”的3支試管中各加入放散液100 μl,并分別加入濃度為3%-5%的A、B、O型標準紅細胞懸液50 μl;在標識為“洗+Ac”的試管中加入最后一次洗液100 μl和濃度為3%-5%的A型標準紅細胞懸液50 μl。將4支試管內(nèi)反應物混勻后用血型血清學專用離心機120 g離心1 min,肉眼和顯微鏡下觀察凝集情況。

    1.3.3FUT1基因測序 采用PCR方法擴增FUT1基因的編碼區(qū)域全長,擴增引物、體系及反應條件參照文獻[1]進行。PCR擴增產(chǎn)物直接送專業(yè)的生物技術公司進行后續(xù)純化和Sanger測序(廣州天一輝遠基因科技有限公司,廣州)。測序結(jié)果用DNASTAR軟件與FUT1基因標準序列(NC_000019.9)進行比對,對堿基變異進行鑒定。

    2 結(jié)果

    2.1 單克隆抗體試劑和標準紅細胞檢測紅細胞血型抗原和抗體結(jié)果

    受檢者紅細胞與單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-Lea、抗-H反應均為陰性,與單克隆抗-Leb反應為3+,O型標準紅細胞與單克隆抗-H反應(陽性對照)為2+;受檢血漿與A型標準紅細胞反應為±,與B型標準紅細胞反應為4+,與O型標準紅細胞反應為1+,表明受檢者血漿中存在較強的抗-B和較弱的抗-H,見表1。

    表1 單克隆抗體試劑和標準紅細胞檢測紅細胞血型抗原和抗體結(jié)果

    2.2 吸收放散試驗結(jié)果

    受檢者紅細胞與B型人血漿的吸收放散液,與A型標準紅細胞反應為1+,與B型和O標準紅細胞反應為陰性。最后一次洗滌液與A型標準紅細胞反應為陰性,表明受檢者紅細胞弱表達A抗原,不表達B抗原,見表2。

    表2 吸收放散液檢測結(jié)果

    2.3FUT1基因測序結(jié)果

    FUT1基因測序檢出c.658C>T純合突變(以往將攜帶有該突變的等位基因命名為h3等位基因,即本例樣本基因型為h3h3)。該突變導致FUT1編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶第220位精氨酸(Arg)突變?yōu)榻z氨酸(Cys),即 p.220Arg>Cys,見圖1。

    圖1 FUT1基因測序結(jié)果

    3 討論

    紅細胞H抗原是國際輸血協(xié)會(ISBT)確認并編號為018的紅細胞H血型系統(tǒng)中唯一的抗原。ABH血型物質(zhì)的表達與ABO、H、Lewis血型系統(tǒng)密切相關,前體物質(zhì)都是多糖R,受ABO、FUT1(H)、FUT3(LE)、FUT2(Se)這4個座位基因控制,ABO、FUT1、FUT3、FUT2的基因產(chǎn)物都是糖基轉(zhuǎn)移酶。ABO編碼A、B糖基轉(zhuǎn)移酶,控制ABO血型系統(tǒng)抗原表達;FUT1編碼α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,控制H抗原表達;FUT3編碼Lewis轉(zhuǎn)移酶,控制Lewis血型系統(tǒng)抗原表達;FUT2 控制ABH分泌型,其Se為ABH分泌型,se為ABH非分泌型,SeW為ABH部分分泌型[2]。

    FUT1基因有兩個等位基因H和h,H等位基因編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶使巖藻糖與前身物質(zhì)多糖R糖鏈末端的半乳糖相連形成H抗原。而H抗原又是A、B抗原的前身物質(zhì),在A、B基因編碼的A、B糖基轉(zhuǎn)移酶作用下分別轉(zhuǎn)化為A、B血型抗原。h等位基因不能編碼具有活性的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,hh純合子個體紅細胞上和分泌液中均無H、A、B抗原,血漿中有抗-H,是非常罕見的孟買血型(Bombay)。當FUT1基因缺陷而FUT2基因正?;蛉醣磉_時可表現(xiàn)為紅細胞上具有很少量或沒有H、A、B抗原,分泌液中含有正常量的H、A、B血型物質(zhì),即為類孟買血型(Para-Bombay)。類孟買型個體血漿中也可存在抗-H[3]。目前報道的與H抗原缺陷相關的FUTl等位基因有50余種[4],在我國最常見的是h1、h2和h3等位基因,突變點分別是FUTI547delAG、FUTl880delTT和FUTl658C>T[5,6]。

    現(xiàn)已明確,紅細胞不能合成Lewis血型系統(tǒng)的Lea和Leb抗原,紅細胞膜的Lea和Leb抗原是從血漿中吸附的Lea和Leb血型物質(zhì),而血漿中的Lea受FUT3(LE)控制,Leb受LE和Se(分泌基因)共同控制。由于ABH分泌型個體FUT2基因型為Se/Se或Se/se,Lewis血型表現(xiàn)為Le(a-b+)或Le(a-b-),而不會表現(xiàn)為Le(a+b-)[7]。

    本例就診者紅細胞與單克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H反應均為陰性,血漿與標準紅細胞反應的凝集強度分別為A型±、B型4+、O型1+,紅細胞吸收放散液(與B型人血漿做吸收試驗)與標準A型紅細胞反應為+,與B型和O型紅細胞反應均為陰性,Lewis血型為Le(a-b+),符合類孟買血型OHmA(紅細胞未檢出H、B抗原,檢出弱表達的A抗原,血漿中檢出較弱抗-H和較強抗-B,根據(jù)Lewis血型可推測其為分泌型)。FUT1基因測序檢出我國常見的c.658C >T純合突變,從分子水平證實本例就診者為類孟買血型。

    類孟買血型個體血漿中可存在抗-H,并由于作為ABO血型抗原前體物質(zhì)的H抗原缺陷,導致正常A、B基因的個體紅細胞不能表達正常的A、B抗原。從而導致ABO血型鑒定正定型紅細胞與單克隆抗-A、抗-B反應無凝集,反定型可由于抗-H的存在而與A、B型紅細胞凝集(凝集強度一般較正常O型人弱),表現(xiàn)為類似O型的反應格局,容易將類孟買血型誤定為“O”型。如類孟買血型個體血漿不存在抗-H,則ABO血型鑒定表現(xiàn)為正反定型反應格局不相符。因此,在常規(guī)鑒定ABO血型時應采用正反定型,反定型應使受檢者血漿(血清)與A、B、O型標準紅細胞反應,對正定型紅細胞與單克隆抗-A、抗-B反應無凝集,正反定型不符或反定型與O型標準紅細胞有凝集者(先排除抗-H以外的紅細胞不規(guī)則抗體),應進行類孟買血型的血清學鑒定,必要時應進行FUT1基因測序,以避免漏檢類孟買血型。

    抗-H是具有臨床意義的紅細胞抗體,不相容輸血可引起免疫溶血性輸血反應,通常認為類孟買血型患者在需要輸血時最好輸用相同H抗原缺乏血型的血液[8]。但由于類孟買血型是非常稀有的血型,其頻率在不同人群中存在差異,泰國為1/5 000,臺灣為1/8 000,香港為1/15 620,我國大陸目前還沒有進行大量樣本的調(diào)查,僅在某些地區(qū)和民族較高,如福建地區(qū)頻率約為1/8 500,而云南少數(shù)民族拉祜族中的頻率高達2.2%[9]。當臨床發(fā)現(xiàn)類孟買血型患者需要輸血治療時很難找到相合供者,對其家系,尤其是同胞兄妹間進行血型血清學調(diào)查,是尋找相合供者的重要途徑。在無法找到相同H抗原缺乏血型血液時,應根據(jù)血型血清學試驗檢測患者抗-A、抗-B、抗-H 的實際情況,選擇37℃與患者血清反應最弱的ABO 血型進行輸血治療[8,10-12]。

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