長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST海綿miR-34通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展的機(jī)制

洪 森,李世權(quán),劉 濤,康振華

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 結(jié)直腸肛門外科,吉林 長(zhǎng)春130021)

結(jié)腸癌是癌細(xì)胞在結(jié)腸組織中形成的最常見的惡性腫瘤之一。作為世界第三大最常見的癌癥和第二大癌癥相關(guān)死亡原因[1]，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在中國(guó)逐漸增加，2015年新增病例376,300例，死亡191,000例[2]。目前，結(jié)腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法包括手術(shù)、放療和化療或聯(lián)合治療[3]。盡管在治療技術(shù)方面取得了巨大進(jìn)步，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌的5年生存率仍然低于40%[4]。闡明結(jié)腸癌的侵襲機(jī)制，探索結(jié)腸癌治療的潛在新靶點(diǎn)勢(shì)在必行。作為一類非編碼RNAs，長(zhǎng)非編碼RNAs(lncRNAs)被定義為長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)基因表達(dá)、翻譯后加工和腫瘤發(fā)生[5]。LncRNAs X-inactive 特異性轉(zhuǎn)錄體(XIST)，來自XIST基因，是哺乳動(dòng)物X染色體轉(zhuǎn)錄沉默的主要調(diào)控者[6]。先前的研究已經(jīng)證實(shí)XIST在多種癌癥中起到了腫瘤調(diào)節(jié)劑的作用，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]、乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、肝細(xì)胞性肝癌[10]。盡管如此，XIST 在結(jié)腸癌中的作用仍然不清楚。

MicroRNAs是一種短的內(nèi)源性非編碼分子(大約19-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)，通過與靶基因的3’-未翻譯的區(qū)域(3’-UTRs)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在維持穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[11]。目前，人們普遍認(rèn)為 miRNAs在腫瘤發(fā)育過程中可能充當(dāng)癌基因或抑制基因[12]。對(duì)miR-34a 的功能性研究已經(jīng)證明它可以抑制結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)假說證明，lncRNAs作為miRNA海綿來調(diào)節(jié)miRNA靶基因的表達(dá)，從而參與癌癥的進(jìn)展。然而，XIST能否與 miR-34a 相互作用調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展還有待于進(jìn)一步闡明。

因此，本研究的目的是調(diào)查XIST在結(jié)腸癌進(jìn)展中的表達(dá)水平，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究的對(duì)象為人類結(jié)腸癌組織和相應(yīng)的非腫瘤組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1病人和組織樣本 所有患者均獲得知情同意，本研究經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在2017年3月至2019年2月期間進(jìn)行初次手術(shù)切除的患者中，獲得了人類結(jié)腸癌組織和相應(yīng)的非腫瘤組織(n=120)。手術(shù)后，標(biāo)本立即冷凍在-80℃以備進(jìn)一步使用。參與研究的患者的特征見表1。

表1 結(jié)腸癌患者XIST表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480,Lovo,HCT116 與 HT29)和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海，中國(guó))。所有細(xì)胞均在含有10% 胎牛血清((FBS公司，美國(guó))和1% 青霉素/鏈霉素的Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium 中(DMEM,Gibco,USA))培養(yǎng)基，在濕潤(rùn)、含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將SW480和HCT116細(xì)胞接種于平板，按照生產(chǎn)廠家的規(guī)定，使用 Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，MA，USA)轉(zhuǎn)染 si-XIST，miR-34a 抑制劑或其陰性對(duì)照(NCs)。

1.2.3細(xì)胞活力測(cè)定 細(xì)胞(3×103)培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h，用0.5 mg/mLMTT染色24 h。去除上清液，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解沉淀。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定儀在490 nm 處測(cè)定每個(gè)孔的光密度(OD值)。

1.2.4菌落形成試驗(yàn) 在集落形成實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞種植到密度為5×103的6孔板中。然后，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)，加入5%CO2，培養(yǎng)2周。最后用4% 多聚甲醛固定菌落，用0.1% 結(jié)晶紫染色30 min。然后，用光學(xué)顯微鏡計(jì)算菌落數(shù)。

1.2.5細(xì)胞遷移試驗(yàn) 將密度為1×105的細(xì)胞分別接種于含1% FBS的培養(yǎng)基上腔。下腔室用10% FBS培養(yǎng)基充填。培養(yǎng)24 h后，上表面粘附的細(xì)胞被去除，遷移至下室的細(xì)胞用0.1% 結(jié)晶紫染色。

1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR分析 根據(jù)制造商的說明書，用trizol 試劑(中國(guó)上海)從細(xì)胞中提取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(takara biotechnology，中國(guó)大連)合成了互補(bǔ)DNA(cDNA)。用定量PCR方法測(cè)定cDNA的相對(duì)數(shù)量，用2-ΔΔCt方法計(jì)算GAPDH基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7熒光素酶報(bào)告分析 將含 miR-34a結(jié)合位點(diǎn)的XIST和WNT1的3’-UTR分別擴(kuò)增并克隆到pGL3-基本熒光素酶載體(Promega，美國(guó))中。細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，并根據(jù)制造商的規(guī)定，將相關(guān)的寡核苷酸(XIST和WNT1野生型或突變型報(bào)告載體miR-34a 模擬或陰性對(duì)照)與脂質(zhì)體2000試劑混合，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega,Madison，美國(guó))轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)熒光素酶活性。用Renilla 熒光素酶作為內(nèi)參照物。

1.2.8Western blotting分析 培養(yǎng)細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌，在添加蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖器中溶解。蛋白樣品經(jīng)電泳后，與從Abcam Campany購(gòu)買的一抗(anti-WNT1,anti-β-catenin,anti-MMP7,anti-cyclinD1,anti-cMyc,1∶1000稀釋)孵育。樣品與辣根過氧化物酶結(jié)合的次級(jí)抗體孵育。用Imagej 軟件量化。

1.2.9動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 5周齡雄性BALB/C裸鼠(體重18±2 g)，日/夜循環(huán)22-24℃，日/夜循環(huán)12 h。皮下異種移植實(shí)驗(yàn)方法:將感染 si-NC或 si-XIST的SW480細(xì)胞(5×105)皮下注射于小鼠右側(cè)(n=6只/組)。每5天檢查一次腫瘤體積，計(jì)算公式為:體積=0.5×長(zhǎng)×寬×高。注射后25天，安樂死處死動(dòng)物，測(cè)量腫瘤重量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得吉大一院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 XIST 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后不良有關(guān)

為了研究XIST在結(jié)腸癌進(jìn)展中的作用，我們使用qRT-PCR檢測(cè)了XIST在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)顯示XIST在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(圖1A)。圖1B顯示每例患者XIST表達(dá)水平(結(jié)腸癌組織標(biāo)本)的倍數(shù)變化。我們將120名患者分為高表達(dá)組(n=68)和低表達(dá)組(n=52)(表1)。結(jié)果顯示XIST上調(diào)與晚期TNM分期、淋巴管及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(圖1C、表1)。但XIST升高與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性(表1)。Kaplan-Meier 總生存率曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)表明，XIST水平高的患者總生存率低于XIST水平低的患者(圖1D)?？傊琗IST在結(jié)腸組織中表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)，提示XIST在結(jié)腸癌中的致癌作用。

圖1 結(jié)腸癌組織中 xist 表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)

2.2 XIST 基因敲除對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用

我們發(fā)現(xiàn)4株結(jié)腸癌細(xì)胞系的XIST表達(dá)水平與正常細(xì)胞系相比上調(diào)(表2)。為了驗(yàn)證XIST基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，通過siRNA轉(zhuǎn)染SW480和HCT116細(xì)胞，建立了穩(wěn)定的XIST基因沉默體系(表3)。MTT測(cè)定XIST基因沉默對(duì)兩種細(xì)胞株的增殖均有抑制作用(表4)。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，XIST沉積可以誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞系形成集落少于對(duì)照細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)表明，XIST沉默抑制了細(xì)胞的入侵能力。

表2 不同細(xì)胞系中XIST相對(duì)表達(dá)量

表3 體外轉(zhuǎn)染SW480和HCT116細(xì)胞系的siRNA建立了XIST沉默表達(dá)結(jié)果

表4 在兩個(gè)細(xì)胞系中si-XIST轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)速度

2.3 XIST作為miR-34的分子海綿

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可以像海綿一樣與特定的miRNA結(jié)合。利用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)了小分子與XIST結(jié)合的候選靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)XIST的3’UTR與miR-34a 結(jié)合的程度非常保守。與鄰近正常組織樣本相比，結(jié)腸癌組織中miR-34a水平降低。與正常細(xì)胞相比，4株結(jié)腸癌細(xì)胞株miR-34a的表達(dá)水平降低。熒光素轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在 miR-34模擬物和XIST野生型中熒光強(qiáng)度降低的結(jié)合。熒光素酶報(bào)告分析證實(shí)了miR-34a抑制劑和XIST野生型的熒光增強(qiáng)結(jié)合。此外，si-XIST 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-34a表達(dá)上調(diào)，而 miR-34a抑制劑可逆轉(zhuǎn)這一過程。MTT實(shí)驗(yàn)表明，miR-34a抑制劑能夠緩解si-XIST對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)表明，miR-34a抑制劑能夠緩解si-XIST對(duì)兩個(gè)細(xì)胞集落數(shù)和遷移數(shù)的抑制作用。

2.4 miR-34a 直接以WNT1的3’-UTR為目標(biāo)

我們使用生物信息學(xué)分析檢測(cè)了miR-34a的計(jì)算預(yù)測(cè)目標(biāo)。結(jié)果顯示W(wǎng)NT1的3’端高度保守，與miR-34a 結(jié)合。WNT1水平在結(jié)腸癌組織中高于相鄰正常組織。WNT1表達(dá)水平在4株結(jié)腸癌細(xì)胞系中高于正常細(xì)胞系。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定表明，轉(zhuǎn)染miR-34a可抑制細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性，提示miR-34a 對(duì) WNT1表達(dá)與WNT1的3’-UTR相互作用具有抑制作用。如圖2，表5所示，在 mRNA和蛋白水平上，在SW480細(xì)胞中miR-34a水平的過度表達(dá)下調(diào)WNT1表達(dá)?？偟膩碚f，miR-34a通過與3’-UTR結(jié)合，抑制WNT1的表達(dá)。

表5 WNT1灰度值測(cè)定結(jié)果

圖2 WNT1 mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果

2.5 XIST沉默抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路

轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，48 h WNT1和β-catenin 表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，si-XIST抑制WNT1和β-catenin的表達(dá)，miR-34a抑制劑可逆轉(zhuǎn)WNT1和β-catenin的表達(dá)。c-Myc、cyclinD1和MMP-7的表達(dá)在PCR和western blot檢測(cè)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，它們是β-catenin 的靶基因。si-XIST能抑制c-Myc、cyclinD1和MMP-7的表達(dá)，這些表達(dá)都是由miR-34a抑制劑調(diào)節(jié)的。

2.6 XIST基因敲除抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

為了進(jìn)一步確定XIST在體內(nèi)是否影響腫瘤發(fā)生，我們將si-NC或si-XIST轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。與si-NC組相比，si-XIST組顯示腫瘤體積、腫瘤大小和重量減少(腫瘤體積變化如表6所示)，表明XIST抑制腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，提示XIST過表達(dá)促進(jìn)了結(jié)腸癌的進(jìn)展。

表6 腫瘤體積變化(mm3)

3 討論

結(jié)腸癌是東西方國(guó)家最常見的癌癥，每年影響超過一百萬人[14]。雖然近年來癌癥診斷和治療的進(jìn)展改善了臨床結(jié)果，但結(jié)腸癌患者的預(yù)后仍然令人沮喪。許多非編碼RNAs(ncRNAs)與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[15]。作為ncRNAs的一個(gè)重要成員，lncRNAs已被報(bào)道在結(jié)腸癌的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16]。Lncrnaxist 是重要的沉默一個(gè)X染色體在女性的發(fā)展[17]。許多研究表明XIST基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致人類癌癥[18]。然而，XIST在結(jié)腸癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，XIST在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且XIST上調(diào)與晚期TNM分期、淋巴管及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。但XIST升高與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性。Kaplan-Meier 總生存率曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)表明，XIST水平高的患者總生存率低于XIST水平低的患者?？傊?，XIST在結(jié)腸組織中表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)，提示XIST在結(jié)腸癌中的致癌作用。

LncRNAs對(duì)常見的miRNAs起著海綿的作用，并消除了這些miRNAs對(duì)其靶向轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)源性抑制作用[19]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)程序，我們發(fā)現(xiàn)XIST基因3’UTR與miR-34a結(jié)合高度保守。si-XIST轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-34a表達(dá)上調(diào)。而miR-34a 抑制劑可以緩解si-XIST對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，這些數(shù)據(jù)表明，它可以通過靶向miR-34a來調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

WNT/β-catenin信號(hào)途徑的異常表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)[20]。作為信號(hào)通路的中樞效應(yīng)器，β-catenin向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位導(dǎo)致生長(zhǎng)和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如 cyclinD1和 c-Myc[21]。生物信息學(xué)分析表明miR-34a與WNT1的3’-UTR密切相關(guān)。此外，miR-34a的過度表達(dá)可降低WNT1 mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)。si-XIST抑制了WNT1和β-catenin 的表達(dá)，miR-34a抑制劑逆轉(zhuǎn)了這兩種表達(dá)。c-Myc、cyclinD1和 MMP-7的表達(dá)在PCR和western blot檢測(cè)中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，它們是β-catenin的靶基因。si-XIST對(duì)miR-34a抑制劑挽救的c-Myc、cyclinD1和MMP-7表達(dá)有抑制作用，這表明XIST通過激活WNT/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述：XIST通過WNT/β-catenin信號(hào)通路在miR-34a 靶向的結(jié)腸癌進(jìn)展中起重要作用，為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)提供了新的認(rèn)識(shí)。