小檗胺聯(lián)合拉帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

朱激揚(yáng) 陳華 徐燕芳

[摘要] 目的 研究小檗胺聯(lián)合拉帕替尼對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影響。 方法 MTT法檢測(cè)不同濃度的小檗胺和拉帕替尼單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用;采用CompuSyn軟件分析不同劑量組聯(lián)合用藥的聯(lián)合指數(shù)CI，確定最佳聯(lián)合方案;將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、小檗胺組、拉帕替尼組以及聯(lián)合用藥組，用篩選出的最佳聯(lián)合劑量分別進(jìn)行藥物干預(yù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果 相對(duì)于單獨(dú)用藥，小檗胺和拉帕替尼聯(lián)合用藥能夠更加顯著地抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;CompuSyn軟件分析結(jié)果顯示各個(gè)劑量聯(lián)合用藥的CI值均<1，表明兩藥具有協(xié)同抑制的作用，選擇CI值最小的劑量組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);與空白對(duì)照組比較，小檗胺組與拉帕替尼組細(xì)胞總凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），與小檗胺組和拉帕替尼組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞總凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 小檗胺聯(lián)合拉帕替尼能夠增強(qiáng)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用以及誘導(dǎo)凋亡作用。

[關(guān)鍵詞] 小檗胺;拉帕替尼;三陰性乳腺癌;增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（b）-0123-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of Berberine combined with Lapatinib on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. Methods MTT assay was used to detect the proliferation inhibition of single application for Berberine， Lapatinib and drug combination at different concentrations in MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. CompuSyn software was used to analyze the combined index CI of different dose groups and determine the best combined scheme. The cells were randomly divided into 4 groups： the blank control group， the Berberine group， the Lapatinib group and the drug combination group， and the optimal combination dose selected was used for drug intervention respectively. Flow cytometry was used to detect apoptosis in each group. Results Compared with the single drug， the combination of Berberine and Lapatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells more significantly， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. CompuSyn software analysis results showed that the CI value of each combined dose was < 1， indicating that the two drugs had synergistic inhibitory effect. The dose group with the lowest CI value was selected for subsequent experiments. Compared with the the blank control group， the total apoptosis rate of the Berberine group and the Lapatinib group increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the Berberine group and the Lapatinib group， the total apoptosis rate of the combined treatment group was increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Berberine combined with Lapatinib can enhance the ability of the proliferation inhibition and induce apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells.

[Key words] Berberine; Lapatinib; Triple negative breast cancer; Proliferation; Apoptosis

三陰性乳腺癌是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達(dá)均為陰性的乳腺癌，其惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1]，占所有乳腺癌的15%～23%[2-3]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是ErbB酪氨酸激酶受體家族的成員，在細(xì)胞遷移和侵襲方面發(fā)揮重要作用[4-5]。拉帕替尼（Lapatinib）作為EGFR的靶向抑制劑，單獨(dú)使用時(shí)的臨床療效不太理想[6-8]。有研究稱[7]，拉帕替尼和伊馬替尼聯(lián)合使用雙靶向抑制EGFR和c-Abl能夠有效抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。小檗胺（Berbamine）是從小檗屬植物中提取的雙芐異喹啉類生物堿，同樣作為c-Abl的抑制劑[9-10]，其與拉帕替尼聯(lián)合使用治療三陰性乳腺癌的研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，分析小檗胺和拉帕替尼單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，尋找最佳聯(lián)合方案，并選用流式細(xì)胞儀觀察聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥材、試劑與儀器

小檗胺（上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1933;純度>98.0%），用DMSO配制成50 mmol/L儲(chǔ)存?zhèn)溆?拉帕替尼（GSK，批號(hào)：J20180012）;DMEM、胎牛血清（Gibco公司，批號(hào)：13100056、1725107）;MTT試劑盒（碧云天，批號(hào)：C0010）;Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Thermo公司，批號(hào)：BMS500F1-201）;超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD）;流式細(xì)胞儀（Calibur DB，USA）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) ?MDA-MB-231細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL的完全培養(yǎng)液DMEM中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)小檗胺與拉帕替尼單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用 ?取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，消化、離心后加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，并控制其細(xì)胞濃度為3000個(gè)/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h至貼壁后，每孔加入10 μL藥物，設(shè)置小檗胺濃度梯度為0、15、20、25、30 μg/mL，設(shè)置拉帕替尼濃度梯度為0、2、4 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后每孔加入200 μL三聯(lián)液，將96孔板放到外用37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用18 h后，用Bio-Rad酶標(biāo)儀在570 nm條件下測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的抑制率和細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.3.3 聯(lián)合指數(shù)及等效線分析法 ?MTT法檢測(cè)單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并將計(jì)算得到的存活率用聯(lián)合用藥軟件CompuSyn分析處理，得到的等效線圖是基于小檗胺與拉帕替尼的計(jì)量-反應(yīng)曲線，其中在等效線下方的數(shù)據(jù)點(diǎn)提示藥物間有協(xié)同作用;在等效線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)提示藥物間屬于疊加作用;在等效線上方的數(shù)據(jù)點(diǎn)提示藥物間有拮抗作用。

1.3.4 AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ?實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、小檗胺組、拉帕替尼組、聯(lián)合用藥組。將狀態(tài)良好的MDA-MB-231細(xì)胞以6×105/孔傳代于6孔板中，等待細(xì)胞貼壁之后，按照分組的情況加入藥物，藥物濃度由CompuSyn軟件分析篩選得到，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細(xì)胞，離心后加入1×Binding buffer 500 μL重懸細(xì)胞成細(xì)胞懸液，分別加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光孵育10 min，采用guava微流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間分析采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗胺與拉帕替尼單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

小檗胺和拉帕替尼均能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并且與單獨(dú)用藥比較，兩藥物聯(lián)合用藥能夠顯著增強(qiáng)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 CompuSyn軟件分析聯(lián)合指數(shù)

根據(jù)MDA-MB-231細(xì)胞在不同濃度的小檗胺和拉帕替尼單獨(dú)及聯(lián)合作用下的存活率，用CompuSyn軟件分析得到等效線圖及聯(lián)合方案的聯(lián)合指數(shù)CI。所有劑量組聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)點(diǎn)均在等效線下方，且CI值均<1，提示兩藥具有協(xié)同作用。其中在拉帕替尼4 μg/mL，小檗胺為25 μg/mL時(shí)，CI值最小，即聯(lián)合效果最佳，以此為最佳聯(lián)合方案進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.3 小檗胺與拉帕替尼單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

采用AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)小檗胺（25 μg/mL）與拉帕替尼（4 μg/mL）單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響?？瞻讓?duì)照組、小檗胺組、拉帕替尼組及聯(lián)合用藥組的凋亡率分別為5.88%、13.9%、20.33%、27.67%。與空白對(duì)照組比較，小檗胺組與拉帕替尼組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞總凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），與小檗胺組和拉帕替尼組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞總凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

腫瘤分子靶向治療是指在腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)上，針對(duì)可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變的環(huán)節(jié)，從分子水平上來(lái)逆轉(zhuǎn)這種惡性生物學(xué)行為，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至使其完全消退的一種全新的生物治療模式[11]。EGFR在細(xì)胞遷移和侵襲方面發(fā)揮著重要的作用，并在肺癌、卵巢癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中高表達(dá)[12-15]。拉帕替尼是同時(shí)靶向EGFR和HER2的小分子口服酪氨酸激酶抑制劑，研究顯示，拉帕替尼與化療藥物聯(lián)用對(duì)食管癌、胃癌及胃食管連接癌均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[16]，但在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼單獨(dú)使用時(shí)的臨床療效卻不太理想[6-8]。非受體酪氨酸激酶c-Abl是一個(gè)多功能的原癌基因蛋白，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及凋亡。研究顯示[17-18]，在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中，c-Abl表達(dá)是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，它在乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲中扮演了重要的角色，且與乳腺癌晚期的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，伊馬替尼是目前應(yīng)用最廣泛的c-Abl抑制劑。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，拉帕替尼和伊馬替尼聯(lián)合使用雙靶向抑制EGFR和c-Abl能夠有效抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。小檗胺作為c-Abl的一個(gè)天然抑制劑[9]，由此推測(cè)，小檗胺聯(lián)合拉帕替尼也能夠抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

小檗胺具有多種生物學(xué)功能，包括促進(jìn)白細(xì)胞增生、抗結(jié)核、抗心肌缺血缺氧、抗心律失常等[19]，近來(lái)有報(bào)道稱它可明顯抑制多種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖，包括白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等[20]。本研究結(jié)果顯示，相比于單獨(dú)用藥，小檗胺與拉帕替尼聯(lián)合用藥能夠更加有效地抑制三陰性乳腺癌的生長(zhǎng)，通過(guò)生物信息軟件證實(shí)兩藥物呈現(xiàn)協(xié)同抑制作用，并篩選出最佳聯(lián)合方案，流式細(xì)胞術(shù)證明聯(lián)合用藥能夠更顯著地誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。本研究提出了一種聯(lián)合用藥新思路，并為三陰性乳腺癌的臨床用藥提供了可能的指導(dǎo)。

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（收稿日期：2020-01-06）