南昌市登革熱傳播媒介白紋伊蚊密度、抗藥性及病原體攜帶監(jiān)測研究

劉仰青，付仁龍，馬紅梅，柳小青

白紋伊蚊(Aedes albopictus)是登革熱、基孔肯雅熱和寨卡病毒病等蚊媒病毒性疾病的重要傳播媒介，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是一種極具入侵能力的蚊種[1-2]。近年來由白紋伊蚊傳播的登革熱在全球范圍內(nèi)已經(jīng)構成了重大公共衛(wèi)生問題，對人類的生命安全造成極大影響。

2014 年在我國廣東、云南、廣西、福建等地相繼暴發(fā)登革熱疫情，此后有關白紋伊蚊密度和抗藥性監(jiān)測在我國得到了廣泛開展[3]。隨著我國依賴殺蟲劑使用的滅蚊運動的強度和廣度不斷加大，白紋伊蚊產(chǎn)生抗藥性的風險也越發(fā)加大。白紋伊蚊是江西省登革熱疾病的唯一傳播媒介，同時也是南昌市城區(qū)的主要蚊種之一，自2011年以來，南昌市每年都有1～2例的輸入性登革熱病例。截止2018年底，南昌市未出現(xiàn)過因登革熱病例輸入引起登革熱本地感染或本地暴發(fā)流行。南昌市作為江西省的省會城市，是政治、經(jīng)濟、文化和交通的中心，登革熱輸入并引起本地暴發(fā)的風險較大，防控形勢十分嚴峻。而目前預防登革熱沒有有效的疫苗，降低伊蚊的密度是登革熱防控的唯一有效途徑，化學防治是目前控制白紋伊蚊的重要手段之一。筆者于2016年對南昌地區(qū)白紋伊蚊進行常用殺蟲劑的抗藥性監(jiān)測，結(jié)果顯示南昌市白紋伊蚊對多種不同類型殺蟲劑產(chǎn)生了中高抗藥性[4]，為進一步了解南昌地區(qū)白紋伊蚊的抗藥性發(fā)展進程和掌握南昌市白紋伊蚊登革熱病毒攜帶情況，筆者于2018年在南昌地區(qū)開展了白紋伊蚊密度、抗藥性和病原體攜帶的監(jiān)測，旨在為合理選擇和使用殺蟲劑、重點控制登革熱傳播媒介和科學防控登革熱疫情提供基礎科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 殺蟲藥劑 幼蟲殺蟲藥劑:97.6%DDVP，94%DDT，99.30%氯氰菊酯，95.56%殘殺威，95.95%溴氰菊酯，92.0%順式氯氰菊酯和92.0%高效氯氰菊酯原藥。成蚊藥膜:0.5%馬拉硫磷，3%氯菊酯，0.1%溴氰菊酯，0.4%高效氯氰菊酯，0.2%殺螟硫磷，0.05%殘殺威和1.4%順式氯氰菊酯成蚊診斷劑量藥紙。

以上測試用藥品及藥膜均由中國疾控中心傳染病預防控制所媒介室標定提供，為全國重要病媒生物抗藥性監(jiān)測用標準品。

1.1.2 監(jiān)測器械 雙層疊帳(外層:1.8 m×1.8 m×1.5 m;內(nèi)層:1.2 m×1.2 m×2.0 m)、計數(shù)器、手電筒、電動吸蚊器等，500 mL水勺。

1.1.3 野外試蟲采集 野外品系試蟲采自南昌市6區(qū)3縣共27個采集點，每縣區(qū)分別從3種不同的生境(居民區(qū)、公園和建筑工地)采集幼蟲，帶回實驗室混合飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1～2代，取其3齡末4齡初幼蟲進行抗藥性測定。取羽化后3～5 d的未吸血的健康雌蚊進行成蚊抗藥性測定。

采用電動吸蚊器于8∶30－10∶00在居民區(qū)、公園和建筑工地等特殊場所房前屋后周圍選擇東、南、西、北、中5個捕蚊點，每點12 min。采集的野外蚊蟲，采用低溫冷藏運輸，于室內(nèi)CO2麻醉后在冷凍臺上進行分類鑒定，挑出白紋伊蚊成蚊，按捕獲地點分組，每10～20只/組，詳細記錄后保存于－70℃冰箱，用于后續(xù)登革熱病毒核酸檢測。

1.2 方 法

1.2.1 白紋伊蚊成蚊和幼蟲密度監(jiān)測 成蚊雙層疊帳法:每生境選擇避風遮蔭處放置蚊帳，在下午媒介伊蚊活動高峰時段(15∶00－18∶00)，誘集者位于內(nèi)部封閉蚊帳中暴露兩條小腿，收集者利用電動吸蚊器在兩層蚊帳之間收集停落在蚊帳上的白紋伊蚊持續(xù)30 min，5－10月每月2次，上下旬各1次，每次2帳次。

帳誘指數(shù)(只/頂·h)＝[捕獲雌蚊數(shù)(只)/蚊帳數(shù)×30 min]×60 min/h

幼蟲布雷圖指數(shù)法(BI):居民區(qū)調(diào)查不少于100戶，公園環(huán)境類型調(diào)查面積不少于3 000 m2，工地調(diào)查不少于100戶(100戶以該工地一層戶數(shù)計算，不夠100戶的，以該工地內(nèi)外環(huán)境每30 m2折算成1戶)。檢查記錄室內(nèi)外所有小型積水容器及其幼蚊孳生情況，收集陽性容器中的幼蚊進行種類鑒定，計算布雷圖指數(shù)，5－10月每月1次。

布雷圖指數(shù)(BI)＝(陽性容器數(shù)/調(diào)查戶數(shù))×100

路徑指數(shù)法和勺舀法參照GB/T 23797－2009《病媒生物密度監(jiān)測方法蚊蟲》。

1.2.2 媒介白紋伊蚊抗藥性監(jiān)測 幼蟲采用浸漬法;成蚊采用接觸筒法。

抗性判定標準:幼蟲的抗性倍數(shù)＜3為敏感;3≤抗性倍數(shù)＜10為低抗;10≤抗性倍數(shù)＜40為中抗;抗性倍數(shù)≥40為高抗[5];成蟲:死亡率＞98%為敏感群體(S);死亡率80%～97%為可能抗性群體(M);死亡率＜80%為抗性群體(R)[6]。

1.2.3 白紋伊蚊成蚊登革熱病原攜帶檢測 將分類鑒定后的白紋伊蚊成蚊進行研磨處理。研磨前用含雙抗(青霉素、鏈霉素，終濃度各1 000 U/mL)的Hank’s液沖洗待檢白紋伊蚊3次后，用研磨器研碎，每組加含雙抗(青霉素、鏈霉素，終濃度各1 000 U/mL)的 Hank’s液0.5 mL，2 000 r/min離心15 min，取上清用于登革熱病毒核酸檢測。

用RT-PCR的方法進行登革熱病毒核酸檢測，具體方法參照《登革熱實驗室檢測指南》中實時熒光定量RT-PCR擴增檢測登革熱病毒核酸標準操作程序(中國疾控中心關于印發(fā)登革熱防制技術指南的通知—中疾控傳防發(fā)〔2014〕360附件2)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 分別利用Excel 2007和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，計算半數(shù)致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間(95%CI)、毒力回歸方程、χ2值、P值及抗性倍數(shù)。

抗性倍數(shù)＝抗性種群LC50/敏感品系LC50

2 結(jié) 果

2.1 不同生境白紋伊蚊密度情況 2018年5－10月，全市雙層疊帳法共誘捕504帳次，其中居民區(qū)312帳次、公園96帳次、工地96帳次。共捕捉到白紋伊蚊成蚊695只，平均帳誘指數(shù)為2.76只/(頂·h)，其中居民區(qū)捕捉到579只白紋伊蚊，帳誘指數(shù)為3個生境最高，為3.71只/(頂·h);工地生境捕捉到的白紋伊蚊最少，帳誘指數(shù)最低，分別為50只和1.04只/(頂·h)(表1)。

全市5－10月布雷圖指數(shù)共調(diào)查12 747戶(居民區(qū)7 874戶、公園2 400戶和工地2 473戶)，共調(diào)查容器數(shù)4 414個，陽性容器數(shù)788個，容器陽性率為17.85%，全年平均布雷圖指數(shù)為6.18。從同生境布雷圖指數(shù)監(jiān)測來看，居民區(qū)最高(BI＝8.98)，其次為工地(BI＝2.06)，公園最低(BI＝1.25)。全市5－10月監(jiān)測共行走距離184.32 k m發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊陽性積水處數(shù)860處，平均路徑指數(shù)為4.67處/k m(表1)。全市勺舀法共調(diào)查固定水體72個，調(diào)查勺數(shù)共396勺，陽性勺數(shù)1勺，陽性率0.25%，蚊幼蟲1只，勺舀指數(shù)為1.0條/勺。

表1 不同生境登革熱傳播媒介白紋伊蚊密度監(jiān)測Tab.1 Density monitoring of A.albopictus in differenthabitats

2.2 不同生境白紋伊蚊成蚊、幼蟲密度季節(jié)變化情況 5－10月南昌市白紋伊蚊成蚊平均密度、幼蟲BI值和幼蟲路徑指數(shù)變化趨勢整體相似。5－6月呈上升趨勢，6月達到最高峰，之后呈逐漸下降。5－9月白紋伊蚊帳誘指數(shù)均大于2，最高峰為6月，達到4.81只/帳·h;5－7月BI值均在5以上，最大為6月份，BI值為10.12(圖1)。

圖1 2018年5－10月南昌市白紋伊蚊成蚊和幼蟲密度季節(jié)消長Fig.1 Seasonal variation,BI value and Route index of Ae.albopictus in Nanchang city,from May to October,2018

從不同生境監(jiān)測情況來看，居民區(qū)、公園和工地生境成蚊活動(帳誘指數(shù))趨勢相似，全年5－6月呈上升趨勢，6月達到最高峰，之后逐漸減低，10月份將至最低。居民區(qū)白紋伊蚊成蚊密度整體遠高于其它2個生境。居民區(qū)幼蟲BI值顯著高于其它2個生境，BI值最高為6月，達到14.63，最低為10月為4.56。公園和工地幼蟲BI值全年均較低，均在5以下。從幼蟲路徑指數(shù)監(jiān)測結(jié)果來看，工地全年路徑指數(shù)比較平穩(wěn)，居民區(qū)和公園路徑指數(shù)5－6月達到最高峰，在6－8月呈急劇下降趨勢(圖2)。

圖2 2018年5－10月南昌市3種不同生境白紋伊蚊成蚊密度、幼蟲BI值及路徑指數(shù)變化Fig.2 Seasonal variation,BI value and Route index of Ae.albopictus in three differenthabitats in Nanchang city,from May to October,2018

2.3 不同縣區(qū)白紋伊蚊成蚊密度、幼蟲BI和路徑指數(shù)空間分布 2018年南昌市BI和路徑指數(shù)空間分布趨勢相同，密度較大的區(qū)域主要集中在位于南昌西部的安義縣和中部的東湖區(qū)和西湖區(qū)。BI最高的是東湖區(qū)7.83，其次為西湖區(qū)6.32，其他縣區(qū)全年BI均在5以下;帳誘法成蚊密度監(jiān)測顯示成蚊密度較高的區(qū)域主要集中在南昌縣(3.54只/頂·h)，其次為與之相鄰的西湖區(qū)(2.92只/頂·h)和青云譜區(qū)(2.33只/頂·h)，其他縣區(qū)均在2只/頂·h以下。

2.4 白紋伊蚊對殺蟲劑敏感性測定

2.4.1 白紋伊蚊成蚊抗性測定 白紋伊蚊成蚊對常用殺蟲劑的抗藥性測定結(jié)果見表2。南昌地區(qū)白紋伊蚊成蚊對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯24 h死亡率分別為56.0%和49.33%，表明已經(jīng)對這2種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性;對順式氯氰菊酯24 h的死亡率為80%，表現(xiàn)出可疑抗性;對馬拉硫磷、氯菊酯、殺螟硫磷和殘殺威均表現(xiàn)為敏感，24 h死亡率均為100.0%。

從1 h內(nèi)殺蟲劑對白紋伊蚊的擊倒效果來看，馬拉硫磷、高效氯氰菊酯、殘殺威和順式氯氰菊酯的擊倒效果最好，1 h內(nèi)的擊倒率均為100.0%;其次為氯菊酯，1 h內(nèi)的擊倒率為90.67%;殺螟硫磷擊倒效果最差，1 h內(nèi)的擊倒率僅為1.33%(表2)。馬拉硫磷和殘殺威對白紋伊蚊具有較好的擊倒和致死效果，高效氯氰菊酯對白紋伊蚊的擊倒效果較好但致死效果較差。相反，殺螟硫磷對白紋伊蚊的擊倒效果差但致死效果強。

2.4.2 白紋伊蚊幼蟲對殺蟲劑的敏感性測定 實驗室敏感品系白紋伊蚊幼蟲對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、DDT、敵敵畏、殘殺威的LC50分別為0.000 42 mg/L、0.000 61 mg/L、0.002 1 mg/L、0.160 6 mg/L、0.002 2 mg/L和0.030 mg/L，參照孫養(yǎng)信等對實驗室內(nèi)敏感白紋伊蚊生物測定的結(jié)果[7]。南昌地區(qū)野外白紋伊蚊對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、DDT、敵敵畏、殘殺威的LC50見表3。室內(nèi)敏感品系白紋伊蚊對順式氯氰菊酯LC50測定結(jié)果為0.001 4 mg/L。南昌地區(qū)白紋伊蚊對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、DDT、敵敵畏、殘殺威和順式氯氰菊酯等殺蟲劑的抗性倍數(shù)分別為71.43、1.21、76.19、33.63、9.09、46.00和17.14倍。白紋伊蚊幼蟲對氯氰菊酯、殘殺威和高效氯氰菊酯產(chǎn)生高度抗性;對DDT和順式氯氰菊酯產(chǎn)生中度抗性;對DDVP表現(xiàn)為低度抗性;對溴氰菊酯表現(xiàn)為敏感(表3)。

表2 白紋伊蚊成蚊對7種殺蟲劑接觸1 h的抗藥性測定(n＝75)Tab.2 Resistance to seven insecticides in adult Ae.albopictus for an hour

2.5 媒介白紋伊蚊登革熱病毒核酸檢測 2010－2018年，每年5－10月采集野外白紋伊蚊成蚊共計2 000余只，將分類后的伊蚊成蚊按照采集地點，每10～20只為一份進行研磨處理，運用實時熒光定量RT-PCR進行登革熱病毒核酸檢測。共采集和檢測野外白紋伊蚊2 000余只，平均20只一批，共檢測100余批，檢測結(jié)果均為登革熱病毒核酸陰性。

圖3 南昌市白紋伊蚊密度空間分布Fig.3 Density distribution of Ae.albopictus in Nanchang city,Jiangxi Province,2018

表3 南昌市野外白紋伊蚊幼蟲對7種不同類型殺蟲劑的敏感性測定Tab.3 Susceptibility of field Ae.albopictus larvae to seven kinds of insecticides

3 討 論

白紋伊蚊是登革熱主要傳播媒介之一，目前尚無有效疫苗預防登革熱，因此控制媒介白紋伊蚊是有效防控登革熱的主要手段，而控制白紋伊蚊，必須了解掌握其種群密度、病原攜帶及抗藥性變化等基礎資料。

本研究結(jié)果顯示南昌地區(qū)2018年全年平均布雷圖指數(shù)(6.18)大于5，全年平均帳誘指數(shù)(2.76只/頂·h)大于2只/頂·h，處于登革熱傳播風險狀態(tài)(5≤BI＜10)，表明一旦有輸入性登革熱病例，南昌市存在登革熱傳播的風險。但不同生境布雷圖指數(shù)監(jiān)測來看，居民區(qū)布雷圖指數(shù)除8月和10月份外，其余月份BI均在5以上，特別是5－7月BI均在10以上，公園和工地生境全年BI均在5以下。BI值是我國登革熱防控的重要指標，居民區(qū)布雷圖指數(shù)大于10，加之居民區(qū)人口密度大，相對集中，一旦有登革熱病例輸入，存在登革熱暴發(fā)的風險，提示應及時將監(jiān)測結(jié)果上報愛衛(wèi)辦。由政府主導，全民參與，加強居民區(qū)內(nèi)翻盆倒罐清除蚊蟲孳生地的愛國衛(wèi)生運動，特別是在5－7月要加強對布雷圖指數(shù)＞5和帳誘指數(shù)＞2只/頂·h的居民區(qū)及時開展蚊蟲防控工作，將蚊蟲密度降低在安全范圍內(nèi)(BI＜5和帳誘指數(shù)＜2只/頂·h)。

從抗藥性監(jiān)測結(jié)果來看，南昌地區(qū)白紋伊蚊幼蟲除對溴氰菊酯表現(xiàn)為敏感外，對DDVP表現(xiàn)為低抗，對氯氰菊酯等其它5種殺蟲劑均表現(xiàn)出中至高度抗藥性，這與作者2017年測定結(jié)果基本相似[4]，但通過抗性監(jiān)測也發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊幼蟲對氯氰菊酯由2017年的敏感已經(jīng)發(fā)展成為高度抗性，對氯氰菊酯的抗藥性倍數(shù)高達76.19倍。白紋伊蚊成蚊對有機磷類殺蟲劑馬拉硫磷和殺螟硫磷比較敏感，對溴氰菊酯、高效氯氰菊酯和順式氯氰菊酯表現(xiàn)為抗性?？剐园l(fā)展與南昌市近幾年的殺蟲劑使用相符，經(jīng)南昌市愛衛(wèi)辦提供的2016－2018年間全市衛(wèi)生殺蟲劑使用情況統(tǒng)計來看，南昌市主要使用商品名為白云(主要成分4.5%順式氯氰菊酯)、康宇(3%高 效氯氰菊酯·5%殘殺威)、洛社(20%辛硫磷和1%高效氯氟氰菊酯)和博士康(3%高效氯氰菊酯和2%殘殺威)等殺蟲劑進行城區(qū)外環(huán)境蚊蠅的防制，且用量較大。早在2002年我國臺灣地區(qū)登革熱大流行，疫情控制失敗，究其原因主要是當?shù)匕＜耙廖脤β染挣ギa(chǎn)生了抗藥性，媒介伊蚊控制失敗所造成[2]。因此，根據(jù)抗性監(jiān)測結(jié)果進一步提示，殺蟲劑使用應因地制宜，根據(jù)抗性監(jiān)測結(jié)果及時停用或者限制使用已經(jīng)產(chǎn)生抗性的殺蟲劑，輪換或混合使用不同類型的殺蟲劑，以延緩和降低伊蚊對殺蟲劑的抗藥性的發(fā)展進程，提高蚊蟲防制效果。同時本研究也揭示大量反復使用同一種或同一類型殺蟲劑能在較短時間內(nèi)大幅提高白紋伊蚊對殺蟲劑的抗性倍數(shù)。本研究采用診斷劑量對南昌市白紋伊蚊成蚊的抗性水平進行測定，從死亡率可以看出，0.1%溴氰菊酯24 h死亡率為56.0%，表現(xiàn)為抗性，可判定為抗性群體，但與其幼蟲1.21倍的抗性存在一定的差異。這與梁文琴對貴陽市白紋伊蚊對溴氰菊酯抗性測定結(jié)果一致[8]。出現(xiàn)幼蟲和成蚊抗性結(jié)果不一致情況還有待于進一步從酶學及分子生物學水平研究認證。同時，我國至今尚沒有針對白紋伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的診斷劑量，因此，只能參考實驗室敏感品系提供的資料，但能否適用于我國的抗藥性評價還有待于進一步考證。

對野外伊蚊登革熱病毒的分子檢測可作為預防登革熱的早期指標，有助于在登革熱流行地區(qū)預防人感染登革熱病毒[9]。目前國內(nèi)對野外白紋伊蚊登革熱病毒檢出率較低，僅見廣州市疾控中心在2015年檢出1批次登革熱病毒核酸樣本[10]。本研究在野外采集的白紋伊蚊成蟲和幼蟲中均未檢測到登革熱病毒核酸陽性標本，提示南昌地區(qū)自然種群白紋伊蚊可能尚未攜帶登革熱病毒或登革熱病毒攜帶率處在較低的水平，但這還需進一步擴大對野外伊蚊標本采集數(shù)量、時間和地域范圍從而做進一步的分離鑒定研究。