2010－2018年安徽省馬鞍山市腹瀉患者中非傷寒沙門(mén)菌的分子分型與耐藥性研究

洪 穎，王 利，陳 謹(jǐn)，王 蓉，羅 穎，楊 晨，陳道利，柳 燕

非傷寒沙門(mén)菌是指除傷寒和副傷寒以外的各種沙門(mén)菌，是一種常見(jiàn)的人獸共患傳染性疾病的病原菌，也是感染性腹瀉的重要病原菌。一項(xiàng)非傷寒沙門(mén)菌疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告顯示，全球每年有9 400萬(wàn)人因沙門(mén)菌患病，15.5萬(wàn)人死亡[1]。據(jù)歐洲食品安全管理局(Efsa)報(bào)道，2016年歐盟超過(guò)9.4萬(wàn)例感染是由非傷寒沙門(mén)菌引起的[2]。在我國(guó)由非傷寒沙門(mén)菌引起的食物中毒事件多年來(lái)居細(xì)菌性食物中毒首位[3]。非傷寒沙門(mén)菌血清型構(gòu)成和優(yōu)勢(shì)型別存在一定的地域特異性[4]，而不同血清型非傷寒沙門(mén)菌的耐藥性也存在顯著不同[5]，因此，非傷寒沙門(mén)菌的血清分型及耐藥性研究對(duì)臨床研究和疾病防控都有著十分重要的意義。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)非傷寒沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè)也進(jìn)入了分子水平，PFGE技術(shù)是一種非常有效的追蹤感染源的分子分型方法，在流行病學(xué)調(diào)查、食源性疾病監(jiān)測(cè)和溯源等工作中均發(fā)揮著重要作用[6]。

基于馬鞍山區(qū)域腹瀉人群中非傷寒沙門(mén)菌的感染狀況、流行特征、血清型分布和分子分型等基線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立，為了解本地區(qū)非傷寒沙門(mén)菌的流行狀況和病原學(xué)特征，現(xiàn)對(duì)2010－2018年來(lái)源腹瀉患者的非傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行血清學(xué)分型PFGE分型和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇馬鞍山市二院、四院、中心醫(yī)院和當(dāng)涂縣醫(yī)院4家定點(diǎn)醫(yī)院作為腹瀉監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)，收集2010－2018年以腹瀉癥狀為主訴、每日腹瀉≥3次、糞便性狀異常的感染性腹瀉病例標(biāo)本共2 998份，同時(shí)收集病例基本信息和流行病學(xué)史;標(biāo)本置于Carry-Blair培養(yǎng)基中冷藏運(yùn)送。

1.2 主要試劑與儀器 SBG增菌液(美國(guó)BD)，沙門(mén)顯色培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID)，克氏雙糖瓊脂(KIA)培養(yǎng)基(英國(guó) OXOID)，SS培養(yǎng)基(英國(guó) OXOID)，XLD培養(yǎng)基(美國(guó)BD)，XbaⅠ酶(美國(guó) New England Biolabs)，蛋白酶 K(美國(guó) Amresco)，Sea Ke m Gol d瓊脂糖(美國(guó)Lonza)，Gel Red染料(美國(guó)Biotiu m)，診斷血清(丹麥SSI)，藥敏檢測(cè)板(上海星佰)，CHEF MAPPER型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)，Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad)，VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀(法國(guó) 梅里埃)，菌液比濁儀(美國(guó)Ther mo fisher)。

1.3 方 法

1.3.1 分離與鑒定 將糞便標(biāo)本保存液接種至SBG增菌液，36℃培養(yǎng)18 h，然后分別接種于沙門(mén)顯色培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和XLD培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h。從中挑取數(shù)個(gè)可疑菌落接種于克氏雙糖瓊脂，36℃培養(yǎng)24 h。可疑菌落用VITEK2全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。鑒定為沙門(mén)菌的菌株依據(jù)文獻(xiàn)[7]確定血清型別。

1.3.2 PFGE分型 按照Pulse Net China“沙門(mén)菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序”操作，以沙門(mén)標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)，選用Xba I酶37℃酶切3 h，電泳19 h，電泳液溫度14℃。電泳結(jié)束后用Gel Red對(duì)膠塊進(jìn)行染色，去離子水洗脫。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，Bio Nu merics7.6軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 按照革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板說(shuō)明書(shū)操作，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI-2018)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。試驗(yàn)使用的抗生素有氨芐西林(A MP)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、亞胺培南(I MI)、美羅培南(MEM)、氨芐西林/舒巴坦(A MS)、阿莫西林/克拉維酸(A MC)、四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DOX)、米諾環(huán)素(MIN)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(A MI)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、左氧氟沙星(LEV)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、磺胺異惡唑(Sul)、氯霉素(CHL)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/C)和頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/C)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)及生物信息學(xué)分析 采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Bio Nu merics7.6軟件對(duì)PFGE圖譜進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 流行特征

2.1.1 時(shí)間分布 2010－2018年馬鞍山市腹瀉患者中非傷寒沙門(mén)菌的感染率為8.8%(263/2 998)，其中2017年最高(16.0%，42/263)，年間感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝72.98，P＜0.001)。2014－2018年，除1月份外各月份均有非傷寒沙門(mén)菌檢出，6－8月份感染率較高，見(jiàn)圖1。

2.1.2 人群分布 2014－2018年腹瀉患者中非傷寒沙門(mén)菌的感染率為11.4%(215/1891)，男性感染率為10.3%(106/1 028)，女性為12.6%(109/863)，不同性別檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.436，P＝0.509)。非傷寒沙門(mén)菌腹瀉病例最小年齡為1歲，最大為91歲，年齡中位數(shù)為26歲，以0～5歲年齡組感染率最高(15.9%，88/554)，年齡組間感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝20.813，P＝0.001)，見(jiàn)表1。

圖1 非傷寒沙門(mén)菌腹瀉病例的時(shí)間分布情況Fig.1 Time distribution of Non-typhoid Salmonella diarrhea cases

表1 2014－2018年不同特征腹瀉病例非傷寒沙門(mén)菌感染率的比較Tab.1 Comparison of Non-t yphoid Salmonella infection rates in different diarrhea cases from 2014 to 2018

2.2 血清型分布 263例非傷寒沙門(mén)菌病例中共分離出265株非傷寒沙門(mén)菌，共有36個(gè)血清型，主要為阿貢納沙門(mén)菌(25.4%)、腸炎沙門(mén)菌(20.4%)和鼠傷寒沙門(mén)菌(20.0%)。不同年份優(yōu)勢(shì)血清型有所不同，2014年以腸炎沙門(mén)菌為主，2015年以鼠傷寒沙門(mén)菌為主，而2016和2017年以阿貢納沙門(mén)菌為主，見(jiàn)圖2。

圖2 2010－2018年非傷寒沙門(mén)菌的血清型分布Fig.2 Serotype distribution of Non-typhoid Salmonella from 2010 to 2018

2.3 PFGE分型 為了解本地區(qū)是否發(fā)生過(guò)沙門(mén)菌腹瀉的既往暴發(fā)并建立和完善沙門(mén)菌的分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究對(duì)所分離的非傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行了PFGE分型。下面列出了阿貢納沙門(mén)菌的PFGE聚類(lèi)圖，62株阿貢納沙門(mén)菌分為25種帶型，帶型相似度在54.7%～100%，帶型相同的有8組，最多的組有19株，帶型結(jié)果顯示阿貢納沙門(mén)菌有成簇出現(xiàn)的情況，見(jiàn)圖3，其他非傷寒沙門(mén)菌未出現(xiàn)菌株成簇現(xiàn)象。

圖3 阿貢納沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)圖譜Fig.3 PFGE clustering patter n of Salmonella Agona

2.4 耐藥性分析

2.4.1 耐藥率 為了解本地區(qū)近年來(lái)2種優(yōu)勢(shì)沙門(mén)菌的耐藥情況，本研究選取2015－2018年分離的39株腸炎沙門(mén)菌和30株鼠傷寒沙門(mén)菌，使用27種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示測(cè)試菌株對(duì)A MP的耐藥率最高為79.7%，對(duì)STR和Sul的耐藥率較高分別為75.3%和66.6%，而對(duì)AZI和AMI全部敏感，見(jiàn)表2。

表2 69株非傷寒沙門(mén)菌對(duì)27種抗生素的耐藥率(%)Tab.2 Resistance rate of 69 strains of Non-typhoid Salmonella to 27 antibiotics(%)

2.4.2 耐藥譜 測(cè)試菌株的總耐藥率為95.6%(66/69)，多重耐藥率為82.6%(57/69)，耐7種及以上藥物的菌株占30.4%(21/69)。耐藥模式為A MP-TET-Sul-MIN-DOX-STR的菌株最多，占8.7%(6/69)。菌株最多可耐16種藥，見(jiàn)表3。發(fā)現(xiàn)2株產(chǎn)ESBLs的菌株，1株為腸炎沙門(mén)菌，1株為鼠傷寒沙門(mén)菌，2株菌均為多重耐藥菌株。

2.4.3 腸炎沙門(mén)菌與鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)各種抗生素敏感性的比較 腸炎沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物(如TET、MIN和DOX)敏感性較鼠傷寒沙門(mén)菌高，而鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物(NAL、CIP和LEV)敏感性較腸炎沙門(mén)菌高。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門(mén)菌對(duì)A MC、GEN和CHL的敏感性較高，而鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)CFZ和Sul的敏感性較高。以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表4。

表3 非傷寒沙門(mén)菌的耐藥譜分布Tab.3 Dr ug resistance spectr um distribution of Non-typhoid Salmonella

表3 (續(xù))

3 討 論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)非傷寒沙門(mén)菌感染率有一定的地域性差異，本研究結(jié)果顯示2010－2018年馬鞍山地區(qū)腹瀉患者中非傷寒沙門(mén)菌的流行特征，非傷寒沙門(mén)菌腹瀉的平均感染率為8.8%，高于安徽合肥(2.9%)[8]，低于浙江余姚(12.9%)[9]。非傷寒沙門(mén)菌在0～5歲兒童組高發(fā)，這與我國(guó)多地區(qū)的研究結(jié)果一致[9-10]，可能與兒童免疫力低下有關(guān)。非傷寒沙門(mén)菌腹瀉具有一定的季節(jié)性，6－7月為高發(fā)時(shí)間，可能由于此段時(shí)間內(nèi)環(huán)境溫度有利于非傷寒沙門(mén)菌的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致沙門(mén)菌感染的幾率增加。因此，建議民眾應(yīng)在感染高發(fā)季節(jié)注意飲食，監(jiān)管部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管力度并做好防控措施。

感染性腹瀉是發(fā)展中國(guó)家的常見(jiàn)疾病，非傷寒沙門(mén)菌是感染性腹瀉的重要致病菌，其中腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌一直是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的2種優(yōu)勢(shì)血清型[11]。而本地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型為阿貢納沙門(mén)菌，這與國(guó)內(nèi)多地區(qū)[8-10，12]的結(jié)果均不一致，阿貢納沙門(mén)菌為優(yōu)勢(shì)血清型是本地區(qū)的流行特點(diǎn)。

當(dāng)今食品流通方式的多樣化使食源性疾病的發(fā)病模式亦發(fā)生改變，由暴發(fā)轉(zhuǎn)為多點(diǎn)散發(fā)。傳統(tǒng)的分型方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足食源性疾病在暴發(fā)中溯源的需求[13]，PFGE目前被廣泛地應(yīng)用于疾病的溯源。建立并完善沙門(mén)菌的分子分型(PFGE)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)了解PFGE分型特點(diǎn)、流行病學(xué)分布、沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè)及暴發(fā)調(diào)查尤為重要[14]。阿貢納沙門(mén)菌的PFGE聚類(lèi)分析顯示有菌株成簇現(xiàn)象，提示本地區(qū)可能出現(xiàn)過(guò)阿貢納沙門(mén)菌腹瀉的既往暴發(fā)或聚集性疫情。

由于抗生素和廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，使得病原菌類(lèi)型變化及耐藥性增強(qiáng)成為感染領(lǐng)域中的首要問(wèn)題[15]。有研究表明[16]2016年我國(guó)食源性沙門(mén)菌整體耐藥水平較高，多重耐藥嚴(yán)重，對(duì) NAL、TET、A MP的耐受性較強(qiáng)，且耐藥情況與2015年保持一致[17]。本研究結(jié)果顯示，測(cè)試菌株對(duì)A MP、STR和Sul的耐藥率較高，總耐藥率和多重耐藥率均高于北京昌平地區(qū)[18]。氟喹諾酮類(lèi)和三代頭孢類(lèi)抗生素是臨床上治療沙門(mén)菌感染的一線(xiàn)用藥[19-21]，而本研究中的測(cè)試菌株對(duì)三代頭孢的敏感性大于90%，對(duì)喹諾酮類(lèi)敏感性低于50%，提示臨床需合理用藥，避免抗生素濫用造成的耐藥菌株的產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的敏感性較高，而鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性較高，這種差異是否與不同沙門(mén)菌的基因組結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

本研究的腹瀉病例為監(jiān)測(cè)人群非傷寒沙門(mén)菌感染數(shù)據(jù)，隨著病例監(jiān)測(cè)力度的加強(qiáng)和范圍加大，以及醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力提高，建立全覆蓋本地區(qū)且監(jiān)測(cè)多種類(lèi)病原的局域網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室將是疾病監(jiān)測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，這樣會(huì)更有利于及早發(fā)現(xiàn)和控制腸道傳染性疾病。

表4 兩種優(yōu)勢(shì)血清型沙門(mén)菌對(duì)藥物敏感性的比較Tab.4 Comparison of drug sensitivity between two dominant serotypes of Salmonella