通遼市家畜感染無形體屬病原體的調查

吳東興，娜仁格日樂，翟景波，白翠蘭，吳七十三，包桂華

病原體分類學上蜱傳立克次體病原體大多數歸屬于立克次體目的立克次體科和無形體科。無形體科的無形體屬(Anaplasma)中主要包括中央無形體(A.centr ale)、牛無形體(A.bovis)、羊無形體(A.capr a)、嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophil um)。這些無形體均可感染牛、羊等家畜，嗜吞噬細胞無形體還可感染人的中性粒細胞引起人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)[1]。HGA是1994年在美國首次報道的新發(fā)現人獸共患病[2-3]。蜱是無形體病原體主要傳播媒介[4-8]，牛、綿羊、山羊、狗、馬、人、鹿等動物可以是其宿主[9-12]。近10多年來，國內陸續(xù)有無形體感染人病例報道，并于2015年首次報道羊無形體感染人病例[13]。

人經攜帶無形體病原體的蜱叮咬后，經過1～2周潛伏期發(fā)病，主要臨床表現為發(fā)熱、身體乏力、頭疼、肌肉酸疼、惡心、嘔吐、腹瀉等[14]。其臨床癥狀有輕有重，很容易誤診為其他發(fā)熱性疾病。內蒙古自治區(qū)地域廣闊，對于蜱傳病原體的種類、分布等相關研究極少。因此，本研究針對蜱傳無形體屬病原體，對通遼地區(qū)綿羊和牛的無形體屬病原體感染狀況進行調查，以便為這些病原體感染的預防和控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 家畜血液樣本采集 2017－2018年在通遼地區(qū)雙龍泉村(N44°31′27.53″;E120°34′18.95″)、香山鎮(zhèn)(N44°28′56.15″;E120°37′20.43″)、東薩拉嘎查(N44°33′51″;E120°29′57″)、協代蘇木鎮(zhèn)(N43°52′15.76″;E123°01′34.75″)和珠日河嘎查(N43°51′117.39″;E122°14′30.42″)5個采集點，共對76只綿羊和20頭牛頸靜脈抽血，每只動物的血液樣本放入普通EDTA抗凝管中保存，在管上注明標號，放置于4℃帶回實驗室備檢。

1.2 血液DNA提取 采用QIAmap DNA Mini kit(QIAGEN)試劑盒，按照說明書步聚提取血液樣本 DNA，QIAmap○RDNA Mini Kit(Qiagen)、乙醇、50×TAE、Agarose G-10、100 bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder、2×Taq PCR Master Mix、EB溶液等購于Solar bio有限公司。

1.3 引物合成 根據國內無形體科屬病原體嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophil um)的特異性16S r RNA基因常規(guī)檢測使用第1輪Eh-out1/Eh-out2引物和第2輪HGA1/HGA2引物是引用于參考文獻[15-16]，新羊無形體(A.capr a)特異性16S r RNA基因引物是引用參考文獻[17]，中央無形體(A.centr al)和牛無形體的特異性16S r RNA基因引物參考文獻[18]。依據相關文獻報道的嗜吞噬細胞無形體、羊無形體、中央無形體、牛無形體的基因擴增引物序列(表1)，委托北京六合華大基因科技有限公司合成相關PCR擴增引物。

1.4 PCR擴增 嗜吞噬細胞無形體16S r RNA和羊無形體glt A基因擴增使用了巢式PCR方法(nested PCR)，第1輪分別采用了Eh-out1和Ehout2、Aca G-OF1和Aca G-OR1引物，第2輪引物是HGA1和HGA2、Aca G-IF2和Aca G-IR2引物(表1);擴增條件為95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min。中央無形體和牛無形體16S r RNA基因擴增使用巢式PCR方法，引物分別為AC1F和AC1R、AB1F和AB2R;擴增條件為95℃變性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸1 min。PCR擴增后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

表1 4種無形體的目的基因引物Tab.1 Target gene primers of four Anaplasma spp.

2 結 果

對內蒙古通遼地區(qū)農家散養(yǎng)的76只綿羊和20頭牛做靜脈采血和采用試劑盒對血樣本提取DNA。使用巢式PCR方法對血液DNA樣本分別進行羊無形體的特異性glt A基因及嗜吞噬細胞無形體、中央無形體和牛無形體的特異性16Sr RNA基因擴增。結果部分綿羊血DNA樣本擴增出嗜吞噬細胞無形體(圖1)和中央無形體的目的基因片段(圖2)。17只扎魯特旗香山鎮(zhèn)綿羊樣本擴增出嗜吞噬細胞無形體目的基因片段，陽性率85.0%(17/20);7只綿羊樣本擴增出中央無形體的目的基因片段，陽性率為35.0%(7/20)。雙龍泉村的9只綿羊樣本擴增出嗜吞噬細胞無形體目的基因片段，陽性率為60.0%(9/15);3只綿羊樣本擴增出中央無形體目的基因片段，陽性率為20.0%(3/15)。東薩拉嘎查的11只綿羊樣本擴增出嗜吞噬細胞無形體目的基因片段，陽性率為52.4%(11/21);6只綿羊樣本擴增出中央無形體目的基因片段，陽性率為28.6%(6/21);珠日河嘎查20只綿羊樣本未能擴增到無形體屬病原體16S r RNA和glt A基因片段(表2)。并且，76只綿羊樣本均未擴增到新羊無形體glt A基因和牛無形體16Sr RNA基因片段，20頭牛樣本均未擴增到4種無形體的目的基因片段。本次研究通遼地區(qū)綿羊的嗜吞噬細胞無形體總感染率為48.7%(37/76)，中央無形體總感染率為21.1%(16/76)。

圖1 綿羊血DNA樣本中擴得的嗜吞噬細胞無形體16S r RNA基因片段電泳圖Fig.1 Electrophoregram of A.phagocytophilum 16S r RNA gene fragment amplified from sheep blood DNA sample

圖2 綿羊血DNA樣本中擴得的中央無形體16Sr RNA基因片段電泳圖Fig.2 Electrophoregram of A.centr ale 16S r RNA gene fragment amplified fromsheep blood DNA sample

表2 通遼地區(qū)綿羊和牛的4種無形體感染率(%)Tab.2 Four Anaplasma spp infection r ates of sheep and cattle in Tongliao area(%)

3 討 論

我國2015年人感染無形體病例首次在Lancet Inf ectious Diseases上報道[17]。2012年國內報道了蜱傳播三倉新埃立克體(Candidatus Neoehrlichia mikurensis)感染[19]。除了新發(fā)無形體病外，內蒙古地區(qū)還有-布魯菌病等人獸共患病流行[20]。但是，通遼地區(qū)的無形體感染牛、羊未見文獻報道。本研究對通遼地區(qū)家畜動物牛、羊攜帶無形體屬病原體(嗜吞噬細胞無形體、中央無形體、牛無形體、羊無形體)的感染進行調查研究。首次從通遼市北部山地草原扎魯特旗的綿羊檢測到嗜吞噬細胞無形體和中央無形體，扎魯特旗處于通遼市西北部，大興安嶺南麓，屬內蒙古高原向松遼過渡地帶，也是山地草原散放牧區(qū)，蜱蟲生息的自然條件優(yōu)越地帶。因此，該地區(qū)的牛、羊易被攜帶無形體感染的蜱叮咬而被感染。然而，通遼地區(qū)中南部科爾沁左翼中旗地區(qū)牛、羊均未能檢測到無形體病原體，原因可能是該地區(qū)主要是農業(yè)為主，而每年禁牧，牛、羊散放于牧場的時間比較短，從而使牛、羊接觸蜱的機會少，該平原草地分布蜱蟲的種類不同，其攜帶病原體也不同。

本次研究首次發(fā)現扎魯特旗綿羊攜帶無形體屬嗜吞噬細胞無形體和中央無形體病原體，并解釋闡明了內蒙古通遼地區(qū)潛在的傳染病。因此有必要對該地區(qū)宿主動物攜帶無形體屬病原體、蜱蟲種類，以及這2種無形體對人感染率做進一步的調查研究，為預警與防控未來突發(fā)傳染病提供科學依據。