湖南省首例豬鏈球菌14型人源分離株鑒定及毒力基因分析

賀子翔，夏 昕，覃玉芳，楊 浩，覃 迪，向星宇，胡俊忠，湛志飛

豬鏈球菌病(streptococcus suis disease)是由多種致病性豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)感染引起的一種人獸共患病[1]。豬鏈球菌是豬身上的一種常見的重要病原體，也可引起人的腦膜炎、敗血癥、心內膜炎、關節(jié)炎和肺炎[1-2]，嚴重者還可導致永久性耳聾、中毒性休克綜合征(toxic shock syndro me，TSS)，甚至導致死亡[3-4]。豬鏈球菌根據莢膜多糖抗原的不同，共分為35個血清型，即1～34型和1/2型，最常見的致病性血清型為2型[5-6]。2006年，湖南省報道了首例人感染豬鏈球菌病例，為豬鏈球菌2型[7]。此后，湖南省人感染豬鏈球菌病時有發(fā)生，人源分離株經實驗室鑒定也均為豬鏈球菌2型菌株。目前，國內關于豬鏈球菌14型人源分離株的報道少見。本研究對2019年就診于湖南某醫(yī)院的1例疑似人感染豬鏈球菌病患者的關節(jié)液進行了菌株分離鑒定與毒力分析，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例信息 患者，男，61歲，為某屠宰廠門衛(wèi)。發(fā)病前7 d內均有接觸外表健康豬，接觸手有1處結痂封閉的深度傷口，且接觸后未及時洗手。發(fā)病前7 d未接觸豬肉，接觸過豬肉熟食。2019年5月29日患者右膝腫痛并于同日入院。病發(fā)后最高體溫38℃，右膝腫脹明顯，浮髕試驗陽性。

1.2 菌株來源 患者關節(jié)液。

1.3 試劑 血瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，VITEK 2革蘭氏陽性細菌鑒定卡和藥敏卡(法國生物梅里埃公司)，豬鏈球菌2型和14型診斷血清(鄭州萬泰生物科技有限公司)，DNA提取試劑盒(QIAGEN DNeasy)PCR引物均購自寶生物工程有限公司，PCR試劑為Ex Taq酶(寶生物工程有限公司)。

1.4 儀器 VITEK 2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃)，9700型PCR儀(Applied Biosystems公司)，全自動核酸分析儀QIAxcel Advanced(Qiagen公司)。

1.5 細菌分離培養(yǎng) 將關節(jié)液接種于血瓊脂平板分區(qū)劃線培養(yǎng)，置37℃，燭缸培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。

1.6 革蘭氏染色鏡檢 挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢，并挑取符合豬鏈球菌鏡下特征的單個菌落轉種至血瓊脂平板純培養(yǎng)，置37℃，燭缸培養(yǎng)24 h。

1.7 生化鑒定和藥物敏感實驗 挑取適量新鮮的純培養(yǎng)菌落，配制菌懸液;填充VITEK 2革蘭氏陽性細菌鑒定卡和藥敏卡，用VITEK 2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定分析。

1.8 血清凝集試驗 挑取新鮮純培養(yǎng)菌落分別與豬鏈球菌2型和14型診斷血清做玻片凝集試驗，同時做生理鹽水對照。

1.9 菌株DNA模板提取 用生理鹽水制備濁度7-10 Ma F的菌懸液，用DNA提取試劑盒制備DNA模板，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 豬鏈球菌分子生物學檢測 參考文獻[5，7-10]合成引物，檢測豬鏈球菌種特異性基因(16S r RNA)，主要毒力因子基因:溶菌酶釋放相關蛋白(muramidase-released protein，mr p)、纖粘連蛋白結合蛋白(fibronectin-binding proteins，f bps)、溶血素(suislysin，sl y)、細胞外因子(extracellular factor，ef)、谷氨酸脫氫酶(gl uta mate dehydrogenase，gdh)、毒力相關序列第二開放讀碼框(open reading fra me 2，or f 2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)，引物序列見表1。PCR反應體系[8]，20μL:Ex Taq HS 0.1μL，10×Ex Taq buffer(Mg2＋plus)2 μL，d NTP Mixt ure 1.6μL，上、下游引物各1μL，dd H2O 13.3μL，DNA模板1μL。PCR反應條件:95℃預變性10 min;95℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán);72℃延伸7 min。擴增產物用全自動核酸分析儀電泳得出結果。

2 結 果

2.1 菌落特征 培養(yǎng)24 h后，可疑菌株在血瓊脂平板上出現灰白色、光滑濕潤、凸起的小菌落，菌落周圍有較明顯的α溶血。見圖1。

2.2 革蘭氏染色鏡檢結果 油鏡下，細菌為革蘭氏陽性球菌，單個散在或短鏈狀排列。見圖2。

2.3 生化鑒定 VITEK2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)報告生化鑒定結果為豬鏈球菌2型(可能性99%)。

2.4 藥物敏感實驗 VITEK2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)報告藥敏實驗見表2。分離株除對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥外，其余藥物均為敏感，且頭孢西丁耐藥機制篩選陰性。

2.5 血清凝集試驗 分離菌株與豬鏈球菌14型診斷血清發(fā)生凝集反應，與豬鏈球菌2型診斷血清不發(fā)生凝集反應，生理鹽水對照不發(fā)生凝集反應。

表1 豬鏈球菌及相關毒力因子基因引物序列Tab.1 Primer sequences of Streptococcus suis and related Virulence genes

圖1 豬鏈球菌14型菌落形態(tài)Fig.1 Colony mor phology of Streptococcus suis type 14

2.6 PCR結果 豬鏈球菌種特異性基因(16S r RNA)陽性，2型莢膜多糖基因(cps 2J)陰性、14型莢膜多糖基因(cps 14J)陽性，毒力基因:溶血素(sl y)、纖粘連蛋白結合蛋白(f bps)、胞外因子(ef)、谷氨酸脫氫酶(gdh)、毒力相關基因(or f 2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因(gap dh)均為陽性，溶菌酶釋放相關蛋白(mr p)為陰性。結果見圖3。

表2 豬鏈球菌14型藥物敏感實驗結果Tab.2 Drug sensitivity test results of Streptococcus suis type 14

圖3 豬鏈球菌14型PCR電泳結果Fig.3 PCR electrophoresis results of Streptococcus suis type 14

3 討 論

1968 年丹麥學者首次報道了3例人感染豬鏈球菌導致腦膜炎并發(fā)敗血癥病例，1975年荷蘭也出現了散發(fā)病例的報道[11]。1999年，董德平等[12]首次在國內報道了人感染豬鏈球菌病病例，為豬鏈球菌2型。2005年，四川省發(fā)生大規(guī)模人感染豬鏈球菌病，204例病例，死亡39例，此次疫情由豬鏈球菌2型引起[13]。其他各省也有豬鏈球菌病散在病例報道。因此，對該菌的快速鑒定和分型以及毒力分析對患者的診治以及疫情的分析處置都尤為重要。此次為湖南省自2006年報道人感染豬鏈球菌2型病例后，首次檢出豬鏈球菌14型病例，表明了新型豬鏈球菌已在湖南省出現，在未來的疫情處置和患者診治中都需引起重視。

VITEK 2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)是微生物快速檢測分析系統(tǒng)，馬麗梅等[14]應用此系統(tǒng)對111株豬鏈球菌進行了鑒定，110株被準確鑒定為豬鏈球菌2型，還有1株被準確鑒定為豬鏈球菌1型，認為VITEK 2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)能夠快速準確檢測和鑒定豬鏈球菌2型，結果可靠。但是此系統(tǒng)也存在局限性，鑒定庫只有豬鏈球菌1型和豬鏈球菌2型兩種鑒定結果。本研究應用此系統(tǒng)對可疑菌株進行了試驗，結果也顯示高鑒定度:豬鏈球菌2型(可能性99%)?？梢妼τ诜?型/2型豬鏈球菌，僅依靠此系統(tǒng)進行鑒定可能會存在不準確的情況。也正因為這種情況的存在，我們通過血清學試驗和莢膜多糖基因檢測，分離株2型血清和2型莢膜多糖基因均陰性，14型血清和14型莢膜多糖基因均陽性，確認分離到的病原菌為豬鏈球菌14型。

藥物敏感性實驗對患者的治療有重要指導意義，分離株對多數抗菌藥物敏感，對豬鏈球菌的主要抗菌藥物如青霉素、氨芐西林、頭孢菌素類[1]均敏感?；颊甙此幟糁笇в盟幒笕鲈?。四川省48例患者分離的豬鏈球菌2型均對四環(huán)素耐藥，對青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟、紅霉素、克林霉素等多種抗菌藥物敏感[15]。湖南1例人源豬鏈球菌2型菌株對四環(huán)素耐藥，對青霉素G、氨芐西林、紅霉素等多種抗菌藥物敏感[7]。許曉燕等[16]研究表明我國的豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥機制主要是由tet(M)基因介導的核糖體保護作用，且tet基因在豬源與人源及其他動物源不同種屬細菌間存在廣泛的交換。此次分離株除對四環(huán)素耐藥外，還出現了對紅霉素、克林霉素的耐藥，提示我們新的耐藥情況的發(fā)生。劉荻萩等[17]研究表明er mB基因介導的腺嘌呤甲基化阻斷大環(huán)內酯類抗生素與核糖體結合是細菌對大環(huán)內酯類的主要耐藥機制。此次分離株對紅霉素和克林霉素的新耐藥，可能與獲得er mB基因有關，有待進一步研究。此次分離株雖然對目前主要治療用抗菌藥物顯示敏感，但仍應引起我們注意，在治療中需要根據藥敏結果選擇藥物，避免新的耐藥的發(fā)生，同時也需關注獸醫(yī)用藥對耐藥的影響。

作為豬鏈球菌的種特異性基因(16S r RNA)一直比較穩(wěn)定，在生化和血清學試劑不全或者診斷不明的情形下，可以更快速有效的鑒定豬鏈球菌的存在，本次分離到的豬鏈球菌14型菌株經PCR擴增，16S r RNA結果為陽性，可以作為豬鏈快速鑒定的檢測方法之一。

本次分離株的毒力基因型為mr p－/sl y＋/f bps＋/ef＋/gdh＋/or f 2＋/gap dh＋。在豬鏈球菌2型菌株的研究中，一般認為sl y、mr p及ef 3個毒力因子可用來區(qū)分高致病、低致病與非致病菌株，sl y、ef、mr p陽性常被認為是與菌株的高致病性相關的[5]。孫珂等[18]對10株豬源豬鏈球菌4型菌株小鼠致病性試驗，ep－、mr p－、sl y－菌株致病性高于ep－、mr p－、sl y＋菌株，證明豬鏈球菌4型與豬鏈球菌2型毒力因子的分布有差異。張振江等[19]研究的1株豬鏈球菌9型菌株，雖然缺失致病性最強的ef、mr p、sl y毒力基因，但在小鼠致病性試驗中亦表現很強的致病力，且該菌株還能引起豬的腦膜炎。王淑杰等[20]對1株豬鏈球菌31型菌株的研究顯示，菌株毒力基因型為gdh＋、mr p－、ef－、sl y－及89PaI－，但小鼠致病性試驗呈現明顯的化膿性腦炎現象。綜上所述，我們可以認為，與豬鏈球菌2型菌株相比，其他型別的毒力基因分布可能存在差異，部分或全部2型菌株中強毒力基因的缺失并不會導致其他型別的菌株致病力的降低。mr p是細胞壁結合蛋白，含有mr p的菌株能逃避吞噬細胞的吞噬，進而選擇性地在上皮細胞中繁殖[21]。在本研究中，患者雖然主要表現關節(jié)炎癥狀，但在隨后的血液培養(yǎng)中同樣檢出豬鏈球菌14型菌株，證實進一步血流感染的存在。因此，此次的14型分離株雖然缺失致病性強的mr p基因，但仍有較強毒性。其致病機理，有待進一步的研究。